Los métodos electrofisiológicos para la grabación de los potenciales sinápticos de la UNM de larvas de Drosophila

Summary

A continuación se describen los métodos electrofisiológicos para la medición de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular de larvas de Drosophila. Liberación evocada se inicia artificialmente mediante la estimulación de los axones de la neurona motora, y la transmisión a través de la UNM se puede medir por la respuesta postsináptica evocado en el músculo.

Abstract

En este video, se describen los métodos electrofisiológicos para la grabación de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular (UNM) de larvas de Drosophila. La larva sistema neuromuscular es una sinapsis modelo para el estudio de la fisiología sináptica y la neurotransmisión, y es una valiosa herramienta de investigación que ha definido la genética y es accesible a la manipulación experimental. Las larvas pueden ser diseccionados para exponer la pared del cuerpo musculatura, el sistema nervioso central, y los nervios periféricos. Los músculos de Drosophila y su patrón de inervación están bien caracterizados y los músculos son de fácil acceso para el registro intracelular. Los músculos individuales pueden ser identificados por su ubicación y orientación dentro de los 8 segmentos abdominales, cada una con 30 músculos dispuestos en un patrón que se repite en los segmentos A2 – A7. Disecados larvas de Drosophila son músculos delgados y el individuo y los haces de axones de neuronas motoras pueden ser visualizados por transiluminación¹. Construcciones transgénicas puede ser utilizada para etiquetar las células diana para la identificación visual o para la manipulación de los productos de genes en tejidos específicos. En las larvas, los potenciales excitatorios cruce (EJPs) se generan en respuesta a la liberación vesicular de glutamato de las neuronas motoras en la sinapsis. En las larvas de disección, el EJP se pueden registrar en el músculo con un electrodo intracelular. Los potenciales de acción puede ser artificialmente evocada en las neuronas motoras que se han cortado por detrás del ganglio ventral, elaborado en una pipeta de vidrio por succión suave y estimulado con un electrodo. Estas neuronas motoras tienen distintos umbrales de disparo cuando se estimula, y cuando el fuego al mismo tiempo, generan una respuesta en el músculo. Las señales transmitidas a través de la sinapsis MNJ se puede grabar en los músculos que la neuronas motoras inervan. El EJPs miniatura y potenciales de unión de excitación (mEJPs) son vistos como los cambios en el potencial de membrana. Respuestas electrofisiológicas se registran en la temperatura ambiente en la modificación mínima hemolinfa, como solución² (HL3) que contiene 5 mg mM^{2 +} Y de 1,5 mM Ca^{2 +}. Los cambios en la amplitud de EJPs evocado puede indicar diferencias en la función sináptica y la estructura. Grabaciones digitalizadas son analizadas por EJP amplitud, frecuencia y amplitud mEJP, y el contenido cuántico.

Protocol

Antes de comenzar preparar: Vagando yhird instar las larvas de Drosophila HL3.1 (Modificado hemolinfa-como) una solución Sylgard (caucho de silicona transparente) platos preparados en la disección pequeño (35 x 10 mm) placas petri de plástico con los métodos descritos por Brent y McCabe (2008) 3. Cortar pernos disección corta Estimular pipetas electrodo Pipetas afiladas grabación HL3 Solución: Du…

Discussion

Los métodos descritos aquí proporcionan una manera relativamente rápida y amplia para detectar los cambios en la función sináptica en la UNM. La capacidad de realizar los registros electrofisiológicos con animales intactos in vivo, y llevar a cabo manipulaciones genéticas o farmacológicas, que Drosophila un modelo animal ideal para investigar los aspectos fisiológicos y genéticos de la neurotransmisión.

Dado que las células musculares son muy grandes, otros prefieren agregar un p…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Small Petri dishes (35 x 10 mm)		Becton Dickinson	1008
SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit		Dow Corning Corporation	3097366-1004
Dissecting microscope		Carl Zeiss	475002-9902
Light for microscope		Schott	KLI500
Dissection pins		Fine Science Tools	26002-10
pClamp 9 software		Axon CNS, Molecular Devices	PCLAMP 9 STANDARD
Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors		Fine Science Tools	15000-0
Dumont SS Forceps		Fine Science Tools	11200-33
Dumont #5 Forceps		Fine Science Tools	11252-20
Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in)		World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4
Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in)		World Precision Instruments, Inc.	1B120F-4
Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller		Sutter Instruments	Model P-2000
Pipette polisher		Narishiga	MF-83
Axon HS-2A head stage		Axon CNS, Molecular Devices	Model HS-2A
Micromanipulators		Sutter Instruments	MP-85
Axoclamp 2B amplifier		Axon CNS, Molecular Devices	AXOCLAMP 2B
Clampex Software		Axon CNS, Molecular Devices	v 8.2.0.235
Mini analysis software. v 6.0.3		Synaptosoft
Brownlee Precision Amplifier		Brownlee	Model 410
NaCl		Baker	4058-01
KCl		Sigma	p-9333
NaHCO3		Sigma	s6297-1kg
Trelahose		Sigma	TO167
Sucrose		Fisher	bp220-212
HEPES		Sigma	h-3375
MgCl-6H2O		Sigma	m2670-1kg
CaCl2		Fisher	c79-500
Master-8 Pulse Generator		A.M.P.I
Vibration table for electrophysiology set up		Technical manufacturing corporation
Faraday Cage