Métodos eletrofisiológicos de gravação Potenciais Synaptic do MNJ de larvas de Drosophila
Summary
Aqui nós descrevemos métodos eletrofisiológicos para medir a transmissão sináptica na junção neuromuscular de larva Drosophila. Liberação evocada é iniciado artificialmente estimulando os axônios do neurônio motor ea transmissão através do MNJ pode ser medida pela resposta pós-sináptica evocado no músculo.
Abstract
Neste vídeo, descrevemos os métodos eletrofisiológicos para a gravação da transmissão sináptica na junção neuromuscular (MNJ) da larva Drosophila. O sistema neuromuscular é uma sinapse larval modelo para o estudo da fisiologia sináptica e neurotransmissão, e é um valioso instrumento de pesquisa que definiu a genética e é acessível à manipulação experimental. As larvas podem ser dissecado para expor o corpo musculatura da parede, sistema nervoso central, e os nervos periféricos. Os músculos de Drosophila e seu padrão de inervação estão bem caracterizadas e os músculos são de fácil acesso para gravação intracelular. Músculos individuais podem ser identificados por sua localização e orientação dentro do 8 segmentos abdominais, cada um com 30 músculos dispostos em um padrão que se repete em segmentos A2 – A7. Dissecados larvas de drosófila são músculos finos e individuais e feixes de axônios do neurônio motor pode ser visualizado por transiluminação<sup> 1</sup>. Construções de transgênicos pode ser usado para rotular as células-alvo para a identificação visual ou para a manipulação de produtos de genes em tecidos específicos. Em larvas, potenciais de junção excitatórios (EJPs) são gerados em resposta a liberação vesicular de glutamato do motoneurônios na sinapse. Em larvas dissecadas, o EJP pode ser gravado no músculo com um eletrodo intracelular. Potenciais de ação podem ser artificialmente evocado nos neurônios motores que foram cortados posterior ao gânglio ventral, atraído para uma pipeta de vidro por sucção suave e estimulado com um eletrodo. Estes neurônios motores têm distintas limiar de disparo quando estimulados, e quando eles atiram simultaneamente, geram uma resposta no músculo. Sinais transmitidos através da sinapse MNJ podem ser gravadas nos músculos que os neurônios motores inervam. O EJPs e miniatura potenciais de junção excitatórios (mEJPs) são vistas como mudanças no potencial de membrana. Respostas eletrofisiológicas são registrados a temperatura ambiente em solução de hemolinfa modificadas-como o mínimo<sup> 2</sup> (HL3) que contém 5 Mg mM<sup> 2 +</sup> E 1,5 mM Ca<sup> 2 +</sup>. Mudanças na amplitude de EJPs evocado pode indicar diferenças na função sináptica e estrutura. Gravações digitalizadas são analisadas para EJP amplitude, mEJP freqüência e amplitude e conteúdo quântica.
Protocol
Discussion
Os métodos descritos aqui oferecem uma maneira relativamente rápida e ampla para detectar mudanças na função sináptica no MNJ. A capacidade de realizar gravações eletrofisiológicas usando animais intactos in vivo, e executar manipulações genéticas ou farmacológicas, fazer Drosophila um modelo animal ideal para investigar os aspectos fisiológicos e genéticos da neurotransmissão.
Como as células musculares são muito grandes, alguns podem preferir adicionar um passo adicional …
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | Becton Dickinson | 1008 | ||
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 3097366-1004 | ||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | 475002-9902 | ||
| Light for microscope | Schott | KLI500 | ||
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| pClamp 9 software | Axon CNS, Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | ||
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | ||
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | ||
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | ||
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | ||
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | ||
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-2000 | ||
| Pipette polisher | Narishiga | MF-83 | ||
| Axon HS-2A head stage | Axon CNS, Molecular Devices | Model HS-2A | ||
| Micromanipulators | Sutter Instruments | MP-85 | ||
| Axoclamp 2B amplifier | Axon CNS, Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | ||
| Clampex Software | Axon CNS, Molecular Devices | v 8.2.0.235 | ||
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | |||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | ||
| NaCl | Baker | 4058-01 | ||
| KCl | Sigma | p-9333 | ||
| NaHCO3 | Sigma | s6297-1kg | ||
| Trelahose | Sigma | TO167 | ||
| Sucrose | Fisher | bp220-212 | ||
| HEPES | Sigma | h-3375 | ||
| MgCl-6H2O | Sigma | m2670-1kg | ||
| CaCl2 | Fisher | c79-500 | ||
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | |||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical manufacturing corporation | |||
| Faraday Cage |
References
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
