Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae
Summary
GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.
Abstract
High-throughput methoden voor het eiwit lokalisatie of organel morfologie te onderzoeken is een effectief instrument voor het bestuderen van eiwit-interacties en kan helpen om een uitgebreide kennis van de moleculaire pathways. In Saccharomyces cerevisiae, met de ontwikkeling van de niet-essentiële gendeletie array, kunnen we wereldwijd de studie van de morfologie van de verschillende organellen zoals het endoplasmatisch reticulum (ER) en de mitochondriën met behulp van GFP (of variant)-merkers in de verschillende genen achtergronden. Echter, waarin GFP markers in elke afzonderlijke mutant is individueel een arbeidsintensief proces. We beschrijven hier een procedure die routinematig gebruikt wordt in ons laboratorium. Door het gebruik van een robotsysteem voor high-density gist arrays en drugs selectie technieken te behandelen, kunnen we aanzienlijk verkorten van de tijd die nodig is en de verbetering van de reproduceerbaarheid. Kortom, steken we een GFP-gelabelde mitochondriale marker (Apc1-GFP) om een hoge dichtheid array van 4672 niet-essentiële genen deletiemutanten door robotachtige replica pinnen. Door middel van diploïde selectie, sporulatie, kiemkracht en dubbele marker selectie, we herstellen beide allelen. Als gevolg daarvan, elk haploïde enkele mutant bevat Apc1-GFP opgenomen in zijn genomische locus. Nu kunnen we de studie van de morfologie van de mitochondria in alle niet-essentiële mutant achtergrond. Met behulp van deze high-throughput benadering, kunnen we gemakkelijk bestuderen en af te bakenen van de paden en genen die betrokken zijn bij de erfenis en de vorming van organellen in een genoom-brede setting.
Protocol
Discussion
Deze methode kan efficiënt te voorzien van een mitochondriale marker, Acp1-GFP in verschillende mutant achtergronden. Zij baseert zich op het gebruik van een robotsysteem, en kan gemakkelijk aangenomen voor gebruik met een robotsysteem. Deze procedure kan ook worden gebruikt voor het opnemen van andere soorten markers. Bijvoorbeeld, om te visualiseren ER, we regelmatig gebruik maken van de marker ERG11-GFP. In onze representatieve beelden, een mutant en een wild-type met de Acp1-GFP maker werden visualiz ed door confoc…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de biotechnologie en biologische wetenschappen Research Council (subsidie 31/C15982), de Canadese Institutes of Health Research, de Canada Foundation for Innovation, de British Columbia Kennis Ontwikkeling, het Michael Smith Foundation for Health Research (te verlenen aan CJR Loewen) en Fight For Sight.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SGA media | The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions. |
References
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2005).
- Tong, A. H., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).
