Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae
Summary
GFP-Fusionsproteine sind weit verbreitet, um Organellen durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen. Allerdings Screening auf Mutationen, die die Morphologie der Organellen beeinflussen erfordert in der Regel individuelle Mutagenese und zeitaufwändig ist. Hier zeigen wir eine Methode, um gleichzeitig aufzunehmen Organellen-GFP-Marker in fast 5.000 Nicht-essentielle Gene in Hefe.
Abstract
High-Throughput-Methoden, um Protein-Lokalisierung oder Organellen Morphologie zu untersuchen ist ein effektives Werkzeug zur Untersuchung der Protein-Wechselwirkungen und kann dazu beitragen, einen umfassenden Verständnis der molekularen Mechanismen. In Saccharomyces cerevisiae, mit der Entwicklung der non-essential Gendeletion Array, können wir global Studie die Morphologie der verschiedenen Organellen wie das endoplasmatische Retikulum (ER) und die Mitochondrien mit GFP (oder eine Variante)-Marker in verschiedenen Gen-Hintergründen. Allerdings Einbeziehung GFP Marker in jeder einzelnen Mutanten individuell ist ein arbeitsintensiver Prozess. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das routinemäßig in unserem Labor verwendet wird. Durch den Einsatz eines Roboters zum High-Density-Hefe-Arrays und Drogen Auswahl Techniken umgehen, können wir deutlich verkürzen den Zeitaufwand und erhöhen die Reproduzierbarkeit. In kurzen, überqueren wir eine GFP-markierten mitochondrialen Marker (APC1-GFP), um ein High-Density Array von 4.672 essentielle Gen-Deletionsmutanten durch Robot-Replik Pinning. Durch diploid Auswahl, Sporulation, Keimung und Dual-Marker Auswahl, gewinnen wir beide Allele. Als Ergebnis enthält jeder haploid einzigen mutierten APC1-GFP in ihrer genomischen Locus integriert. Jetzt können wir untersuchen die Morphologie der Mitochondrien in alle nicht unbedingt mutierte Hintergrund. Mit diesem High-Throughput-Ansatz können wir bequem studieren und beschreiben die Wege und Gene in der Vererbung und der Bildung von Organellen in einer genomweiten Einstellung beteiligt.
Protocol
Discussion
Diese Methode kann effektiv helfen enthalten eine mitochondriale Marker, ACP1-GFP in verschiedenen Mutanten Hintergrund. Es beruht auf der Verwendung eines Robot-System, und kann leicht für die Verwendung mit jedem Roboter-System übernommen. Dieses Verfahren kann auch für die Einbeziehung anderer Arten von Markierungen verwendet werden. Zum Beispiel, zu visualisieren ER, verwenden wir routinemäßig die Markierung ERG11-GFP. In unserer repräsentativen Bilder, ein mutiertes und ein Wildtyp mit der ACP1-GFP-Hersteller…
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Biotechnology and Biological Sciences Research Council (Stipendium 31/C15982), der Canadian Institutes of Health Research, der Canada Foundation for Innovation, die British Columbia Knowledge Development Fund, der Michael Smith Foundation for Health Research (Zuschuss zu CJR unterstützt Loewen) und Fight For Sight.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SGA media | The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions. |
References
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2005).
- Tong, A. H., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).
