Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

Summary

GFP-fusion proteine ​​sono ampiamente utilizzati per visualizzare organelli mediante microscopia confocale. Tuttavia, lo screening per le mutazioni che influenzano la morfologia degli organelli generalmente richiede mutagenesi individuale e richiede molto tempo. Qui, dimostriamo un metodo per integrare simultaneamente organello-GFP marcatori in quasi 5.000 non essenziali geni nel lievito.

Abstract

High-throughput metodi per esaminare la localizzazione di proteine ​​o morfologia organello è uno strumento efficace per studiare le interazioni delle proteine ​​e può aiutare a raggiungere una comprensione completa delle vie molecolari. In Saccharomyces cerevisiae, con lo sviluppo del non essenziali serie gene cancellazione, siamo in grado di studiare a livello globale la morfologia degli organelli diversi, come il reticolo endoplasmatico (ER) e la GFP mitocondri utilizzando (o variante)-marcatori in geni diversi contesti. Tuttavia, i marcatori GFP incorporando in ogni singolo mutante è individualmente un lavoro processo ad alta intensità. Qui, descriviamo una procedura che viene normalmente utilizzato nel nostro laboratorio. Utilizzando un sistema robotico per gestire array ad alta densità di lievito e le tecniche di selezione dei farmaci, siamo in grado di ridurre significativamente il tempo richiesto e migliorare la riproducibilità. In sintesi, attraversiamo un GFP-tagged marcatore mitocondriale (Apc1-GFP) ad un alta densità serie di 4.672 mutanti delezione del gene non essenziale dalla robotica replica pinning. Attraverso la selezione diploide, sporulazione, germinazione e la selezione marcatore duale, abbiamo recuperare entrambi gli alleli. Come risultato, ogni mutante aploide singolo contiene Apc1-GFP incorporato al suo locus genomico. Ora, possiamo studiare la morfologia dei mitocondri in tutti i non essenziali sfondo mutante. Utilizzando questo approccio high-throughput, possiamo comodamente studiare e delineare i percorsi e geni coinvolti nella eredità e la formazione di organelli in un genoma impostazione.

Protocol

Materiali e metodi: Ceppi di lievito: Acp1-GFP (GFP:: Il suo): C-terminale GFP-tagging delle Acp1 è stato generato da una PCR-mediata mediante ricombinazione omologa pKT128 plasmide (GFP e contiene HIS5). Trasformanti positivi sono stati confermati mediante microscopia confocale e colonia PCR. Lo sfondo ceppo è stato BY7043 (MAT alfa can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) da Boone laboratorio (Tong e Boone, 2006). Cancellazione Array Mutant (DMA) (xxx:: Kan…

Discussion

Questo metodo può aiutare in modo efficiente incorporare un marcatore mitocondriale, Acp1-GFP in vari contesti mutante. Essa si basa sull'utilizzo di un sistema robotico, e può essere facilmente adottata per l'utilizzo con qualsiasi sistema robotico. Questa procedura può essere utilizzata anche per l'integrazione di altri tipi di marcatori. Ad esempio, per visualizzare ER, si usano abitualmente il marcatore Erg11-GFP. Nelle nostre immagini rappresentative, un mutante e un tipo selvaggio con la Acp1 GFP-cr…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
SGA media				The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions.