グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法
Summary
GFP融合タンパク質は、広く共焦点顕微鏡による細胞小器官を可視化するために使用されます。しかし、細胞小器官の形態に影響を与える変異のスクリーニングは通常、個々の変異誘発を必要とし、時間のかかる作業です。ここで、我々は同時に、酵母のほぼ5000の非必須遺伝子のオルガネラ- GFPマーカーを組み込む方法を示しています。
Abstract
タンパク質の局在や細胞小器官の形態を調べるためにハイスループット法は、タンパク質相互作用を研究するための効果的なツールであり、分子経路の包括的な理解を達成するのに役立ちます。出芽酵母では、非必須遺伝子の欠失配列の発展とともに、我々は世界的に小胞体（ER）およびミトコンドリアを使用してGFP（または変異型）マーカー異なる遺伝子背景のようなさまざまな細胞小器官の形態を学ぶことができます。しかし、それぞれの単一変異に組み込んだGFPマーカーは、個別に労働集約的なプロセスです。ここで、我々は日常的に我々の研究室で使用されている手順を説明します。高密度の酵母アレイと薬剤選択のテクニックを処理するためのロボットシステムを使用することによって、我々は、大幅に必要な時間を短縮し、再現性を向上させることができます。簡単に言えば、我々はロボットレプリカ確保することにより、4672非必須遺伝子の欠失変異体の高密度配列にGFP -タグ付きミトコンドリアマーカー（Apc1 – GFP）を渡ります。二倍体の選択、胞子形成、発芽およびデュアルマーカーの選択を通じ、我々は両方の対立遺伝子を回復する。その結果、それぞれの半数体の単一変異体は、そのゲノム遺伝子座に組み込まApc1 – GFPが含まれています。今、我々はすべての非本質的な変異体バックグラウンドにおけるミトコンドリアの形態を学ぶことができます。このハイスループットアプローチを使用して、私たちは便利な研究とゲノム全体の設定の継承と細胞小器官の形成に関与する経路と遺伝子を描くことができる。
Protocol
Discussion
このメソッドは、様々な変異体背景にミトコンドリアマーカー、Acp1 – GFPを組み込む効率的に助けることができる。それは、ロボットシステムの使用に依存しており、簡単にロボットシステムで使用するために採用することができます。この手順は、マーカーの他のタイプを組み込むために使用することができます。例えば、ERを視覚化するために、我々は日常的にマーカーErg11 – GFPを使う。?…
Acknowledgements
この作品は、バイオテクノロジーおよび生物科学研究会議（助成金31/C15982）、保健研究、イノベーションのためのカナダ財団、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金、健康研究のためのマイケルスミス財団（助成金CJRへのカナダの協会によってサポートされていましたローウェン）、およびサイトのファイト。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SGA media | The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions. |
References
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2005).
- Tong, A. H., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).
