En hög genomströmning metod för att globalt studera organell morfologi i S. cerevisiae

Summary

GFP-fusionsproteiner används ofta för att visualisera organeller av konfokalmikroskopi. Kräver dock screening för mutationer som påverkar morfologi av organeller i allmänhet enskilda mutagenes och är tidskrävande. Här visar vi en metod att samtidigt införliva organell-GFP markörer i nästan 5000 icke väsentliga gener i jäst.

Abstract

Hög kapacitet metoder för att undersöka protein lokalisering eller organell morfologi är ett effektivt verktyg för att studera protein interaktioner och kan bidra till att uppnå en övergripande förståelse av molekylära vägar. I Saccharomyces cerevisiae, med utvecklingen av den icke-väsentliga gendeletion array, kan vi studera globalt morfologi av olika organeller såsom det endoplasmatiska retiklet (ER) och mitokondrier med GFP (eller variant)-markörer i olika gen bakgrund. Är dock att införliva GFP markörer i varje enskild mutant sig en arbetsintensiv process. Här beskriver vi en procedur som rutinmässigt används i vårt laboratorium. Genom att använda ett robotsystem för att hantera hög densitet jäst arrayer och droger tekniker urval, kan vi förkorta avsevärt den tid som krävs och förbättra reproducerbarhet. I korthet, korsar vi en GFP-märkta mitokondriella markör (Apc1-GFP) till en hög densitet rad 4672 onödiga mutanter gendeletion av robotliknande kopia nåla. Genom diploid urval, sporulering, groning och dubbla markör val återhämta vi båda alleler. Som ett resultat, innehåller varje haploida enda mutant Apc1-GFP införlivas på sin genomiska locus. Nu kan vi studera morfologi av mitokondrier i alla icke-väsentliga mutant bakgrund. Med denna hög genomströmning arbetssätt kan vi studera bekvämt och avgränsa vägar och gener inblandade i arv och bildandet av organeller i en genomet hela inställningen.

Protocol

Material och metoder: Jäststammar: Acp1-GFP (GFP:: Hans): C-terminal GFP-märkning av Acp1 genererades av en PCR-medierad homolog rekombination med hjälp av plasmid pKT128 (innehåller GFP och HIS5). Positiva transformants bekräftades av konfokalmikroskopi och koloni PCR. Stammen Bakgrunden var BY7043 (MAT alpha can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) från Boone lab (Tong och Boone, 2006). Borttagande Mutant Array (DMA) (xxx:: KanR): Det är en samling av …

Discussion

Denna metod kan hjälpa effektivt införliva en mitokondriell markör, Acp1-GFP i olika muterade bakgrunder. Det bygger på användning av ett robotsystem, och kan enkelt antagits för användning med någon robotsystem. Detta förfarande kan även användas för att införa andra typer av markörer. Till exempel att visualisera ER använder vi rutinmässigt markören Erg11-GFP. I vår representativa bilder, en mutant och en vild typ med Acp1-GFP skapare var visualiz ed av konfokalmikroskopi att studera mitokondrier mor…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
SGA media				The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions.