वयस्क चूहा हार्ट Myocytes के प्राथमिक संस्कृति
Summary
इस पत्र में, हम एक ठेठ को अलग और संस्कृति वयस्क चूहे दिल myocytes वर्णित है. Collagenase और protease को पचाने के लिए और एक myocytes अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है. Myocytes सुसंस्कृत सबसे अधिक प्रयोग आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए इस प्रोटोकॉल का पालन करें.
Abstract
संवर्धित प्राथमिक वयस्क कृंतक हृदय कोशिकाओं हृदय अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली रहे हैं. फिर भी, मजबूत, व्यवहार्य सुसंस्कृत वयस्क myocytes की स्थापना के एक तकनीकी चुनौतीपूर्ण, कई शोधकर्ताओं के लिए कदम दर को सीमित किया जा सकता है. यहाँ हम एक प्रोटोकॉल वर्णित वयस्क चूहे दिल myocytes कि संस्कृति में कई दिनों के लिए व्यवहार्य रहने का एक उच्च उपज प्राप्त की. दिल और अलग है कम Ca के तहत collagenase और protease साथ perfused<sup> 2 +</sup> शर्तों एकल myocytes ठीक करने के लिए. Ca<sup> 2 +</sup> सहिष्णु कोशिकाओं कोशिकी CA में stepwise बढ़ जाती है के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं<sup> 2 +</sup> तीन बाद धोने चरणों में एकाग्रता. कक्ष फ़िल्टर संस्कृति माध्यम में resuspended, और laminin लेपित निकल जाता है पर मढ़वाया. संवर्धित प्राप्त myocytes इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर चार दिनों के लिए व्यवहार्य हैं और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, जैव रसायन, इमेजिंग और आण्विक जीव विज्ञान सहित अधिकांश प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं.
Protocol
Discussion
एक महत्वपूर्ण कदम की गति के साथ जो अलग दिल छिड़काव प्रणाली पर लटका दिया है. enzymatic पाचन की अवधि के एक छोटे से प्रत्येक चूहे के लिए अलग अलग लंबाई हो सकता है. समायोजन कैसे नरम दिल पाचन की नियमित अवधि के बाद हो ज?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S6191 | ||
| KCl | Sigma | P9541 | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | ||
| K2HPO4 | Sigma | P9666 | ||
| MgSO4 | Fluka | 63068 | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | ||
| CaCl2 | Sigma | C7902 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H4784 | ||
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| Protease XIV | Sigma | P5147 | ||
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | ||
| Carnitine | Sigma | C9500 | ||
| Taurine | Sigma | T0625 | ||
| Glutamic Acid | Sigma | G1501 | ||
| BSA | Sigma | A3294 | ||
| Creatine | Sigma | C3630 | ||
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | ||
| Media 199 | GIBCO | 11150 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Laminin | BD Bioscience | 354232 | ||
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | ||
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | ||
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. a. k. a. h. a. s. h. i., Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
