Primär kultur Vuxen myocyter Rat hjärta

Summary

I denna uppsats beskrev vi ett typiskt sätt att isolera och kultur vuxna myocyter råtta hjärta. Kollagenas och proteas används för att smälta och isolera enstaka myocyter. Myocyter odlade följa detta protokoll uppfyller de flesta experiment krav.

Abstract

Odlade primära vuxna gnagare hjärtceller är en viktig modell för kardiovaskulär forskning. Icke desto mindre kan inrättandet av robusta, hållbara odlade vuxen myocyter vara en tekniskt utmanande, hastighetsbegränsande steget för många forskare. Här har vi beskrivit ett protokoll för att få en hög avkastning av vuxna myocyter råtta hjärta som förblir livskraftiga kulturen i flera dagar. Hjärtat är isolerade och perfusion med kollagenas och proteas vid låga Ca^{2 +} Förutsättningar att återhämta enda myocyter. Ca^{2 +} Toleranta celler erhålls genom stegvis ökning av extracellulärt Ca^{2 +} Koncentration i tre efterföljande tvätt steg. Celler filtreras, suspenderade i odlingsmedium, och pläterade på laminin belagda slirar. Odlade fått myocyter använda det här protokollet är lönsamt för upp till fyra dagar och passar de flesta experiment med elektrofysiologi, biokemi, bildbehandling och molekylärbiologi.

Protocol

Del I. Förberedelse för operation Dagen före råtta operationen, se till att alla lösningar är gjorda, men inte lägga till några enzymer ännu. Buffertar A, B och tvättbufferten alla bör filtreras för sterilitet före lagring. Buffertar bör alla vara förvaras vid 4 ° C. 6-och vävnadsodling plattor måste vara klädd med 10-20 mikrogram / ​​ml laminin i 2 ml 1XSFM dagen innan också, och bör förvaras vid 37 ° C i en CO 2 inkubator. På dagen för operationen,…

Discussion

Ett avgörande steg är den hastighet med vilken den isolerade hjärtat hängs upp på perfusion systemet. Längden på enzymatisk spjälkning perioden kan vara lite olika för varje råtta. Justeringen beror på hur mjukt hjärta blir efter ordinarie digestionstid. Den sakta återhämtning av Ca ^{2 +} efter enzymet matsmältning är viktigt för att erhålla ^{Ca2 +-toleranta} friska celler.

För marsvin, är protokollet desamma förutom hyaluronidas används i stället fö…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
NaCl		Sigma	S6191
KCl		Sigma	P9541
HEPES		Sigma	H4034
K2HPO4		Sigma	P9666
MgSO4		Fluka	63068
Glucose		Sigma	G7021
CaCl2		Sigma	C7902
Heparin Sodium Salt		Sigma	H4784
Collagenase Type II		Worthington Biochemical	LS004176
Protease XIV		Sigma	P5147
2,3-Butanedione Monoxime (BDM)		Sigma	B0753
Carnitine		Sigma	C9500
Taurine		Sigma	T0625
Glutamic Acid		Sigma	G1501
BSA		Sigma	A3294
Creatine		Sigma	C3630
Antibiotic		Cellgro	30-009-CI
Media 199		GIBCO	11150
FBS		Hyclone	SH30071.03
Laminin		BD Bioscience	354232
water bath		Fisher Scientific	15-462-5
variable flow chemical pump		Fisher Scientific	15-077-67
6-well culture plate		Corning	3516