Antivegetativa monostrati auto-assemblati su microelettrodi per Biomolecole Patterning

Summary

Vi presentiamo una procedura per la formazione di un poli (glicole etilenico) auto-assemblati monostrato (PEG-SAM) su un substrato di silicio con microelettrodi d'oro. Il PEG-SAM è formato in un unico passaggio ed evita biofouling sulle superfici di silicio e oro. Elettroforesi viene quindi utilizzato per biomolecole patterning fino alla scala nanometrica.

Abstract

Vi presentiamo una procedura per la formazione di un poli (glicole etilenico) (PEG) trimetossisilano monostrato auto-assemblato (SAM) su un substrato di silicio con microelettrodi d'oro. Il PEG-SAM si forma in un passo unico assembly ed evita biofouling sulle superfici di silicio e oro. La SAM è utilizzato per microelettrodi cappotto fantasia con lo standard, positivo-tono litografia. Utilizzando il microtubulo come esempio, si applica una tensione continua di indurre la migrazione elettroforetica al SAM-elettrodo rivestito in modo reversibile. Una camera di flusso viene utilizzato per l'imaging e la migrazione elettroforetica patterning microtubuli

Protocol

Preparazione dei reagenti

Preparare tampone TUBI (80 TUBI mM, 1 mM MgCl _2, 1mM EGTA, portato a pH 6,8 con KOH). Aliquota e glucosio ossidasi negozio, la catalasi e il glucosio a -70 ° C e taxolo a -20 ° C secondo i protocolli esistenti. ^1,2 Aliquotare e tubulina conservare a -70 ° C secondo le istruzioni fornite dal fornitore.

Modello microelettrodi Au utilizzando la litografia

1. Tagliare wafer di silicio in 1,5 1 cm 'substrati cm usando una scriba o taglierino wafer. Pulire i substrati mettendoli in un bicchiere con acetone sufficiente a coprirli e sonicare per 5 minuti. Senza che i substrati ad asciugare, sciacquare in acetone fresco, poi risciacquare immediatamente in isopropanolo e asciugare con azoto.
2. Realizzare microelettrodi Au sui substrati pulita utilizzando le normali, positivo-tono fotolitografia o la litografia a fascio elettronico, a seconda delle dimensioni delle caratteristiche desiderate. ³ Nel progettare la geometria del modello, tenere il diametro di ciascun modello elettrodo inferiore a 100 micron per garantire la copertura del PEG SAM (descritto nella sezione successiva). Includono cuscinetti di contatto (~ 300 mm ²⁾ posizionato 300 a 500 mm dal modello con una linea 1 millimetro di collegare il pad con l'elettrodo (Fig. 1). Posizionare i modelli litografica vicino al centro del supporto per consentire lo spazio intorno al modello per il montaggio della camera di flusso.
   
   Figura 1. Geometria del campione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.
3. Dopo lo sviluppo del modello nel resistere strato, zero una linea nella resistere dal pad di contatto al bordo del substrato con una pinzetta (Fig. 1). Al deposito di metallo, il graffio permetterà il contatto elettrico tra l'elettrodo e il bordo del supporto. Una camera di deposizione, preferibilmente con due fonti, è utilizzato per depositare lo strato di metallo. Gli elettrodi sono formati dalla deposizione di 2 nm di Cr (per adesione) seguito da 6 nm di Au, senza rompere il vuoto. Un cristallo di quarzo microbilancia attrezzata all'interno della camera può essere utilizzato per misurare lo spessore del film durante la deposizione.

Preparare la SAM

1. Preriscaldare il forno e in una zona ben ventilata a 75 ° C. Preparare la soluzione silanizzazione con l'aggiunta di 20 ml di toluene in un becher da 250 ml in vetro. Quindi aggiungere 1 mL PEG-silano (5% v / v) al toluene con una pipetta di plastica. Mescolare nel PEG-silano e pipettando su e giù 5 a 10 volte e poi mescolando con la pipetta per 30 secondi.
2. Posizionare i campioni fantasia nel bicchiere con il lato rivolto verso l'alto a motivi geometrici, assicurandosi che essi siano completamente immersi nel PEG-silano soluzione toluene e sono distribuiti uniformemente sul fondo del bicchiere. Porre il bicchiere in forno e cuocere 18-21 ore a 75 ° C. Mentre il SAM si sta formando, preparare il controelettrodo (vedi sotto) e assemblare i componenti aggiuntivi necessari per i passaggi rimanenti.
3. Dopo 18-21 ore nel forno, il toluene dovrebbe evaporare lasciando i campioni di fantasia in un viscoso PEG-silano residui. Aggiungere 20 mL di toluene al bicchiere e immergere i campioni per 1-2 minuti. Rimuovere i campioni dal bicchiere e sciacquare con toluene, poi isopropanolo, ed infine asciugare con azoto. A questo punto, i campioni devono look pulito e lo strato SAM dovrebbe essere invisibile ad occhio nudo. SAM preparato in questo modo sono utilizzabili fino a due giorni se conservato in luogo fresco e asciutto (25 ° C, umidità moderata). Infruttuoso risultati formazione SAM in un rivestimento nuvoloso o irregolari residui hued sulla superficie.

Realizzare il controelettrodo

Nella configurazione stessa camera di deposizione utilizzate per la deposizione di microelettrodi, fare un controelettrodo depositando 1 nm di Cr, seguiti da 4 nm di Au su un x 22 50 mm N ° 1 e n ° 0 coprioggetto di vetro. Il controelettrodo dovrebbe essere quasi trasparente con una tinta grigio chiaro o rosa. Conservare il controelettrodo rivestito-side-up in una capsula di Petri per tenerlo pulito.

Tubulina polimerizzano in MT

1. Disgelo senza etichetta tubulina e tubulina rodamina e subito si combinano con un rapporto di 1:2 etichettati in modo da non marcata per ottenere brillanti MTS. Mescolare pipettando su e giù parecchie volte. Polimerizzare la tubulina per 20-40 minuti in un bagno d'acqua riscaldata a 37 ° C. La lunghezza del MTs sarà maggiore per i tempi di polimerizzazione più lunghi. Mentre la tubulina è polimerizzazione, preparare una TUBI-taxolo tampone con l'aggiunta di taxolo a 20 mm in una provetta contenente tampone TUBI. Mescolare bene il taxolo pipettando su e giù parecchie volte e vortex, e quindi inserire il tubo nel bagno riscaldato a 37 ° C. Dopo la polimerizzazione, diluire il MT da 1 / 100 nel warm-taxolo PIPES buffer e scudodalla luce. MT preparato in questo modo si allungano nel tempo e bundle, che può essere ridotto di ulteriore diluizione.
2. Preparare una miscela di ossigeno scavenging 10x (OS) combinando 30 mL TUBI tampone a freddo (0-4 ° C), 5 ml di 50% 2-mercaptoetanolo, 5 glucosio ossidasi mL, 5 mL catalasi, glucosio e 5 ml. ² Il glucosio deve essere aggiunto scorso. Mescolare pipettando su e giù per 3-5 volte dopo l'aggiunta di ogni componente. Mettere il composto OS su ghiaccio, ma rimarrà efficace per circa 2 ore.
3. Verificare che la polimerizzazione MT ha avuto successo e che le MT sono stabili sotto alcuni minuti di eccitazione di fluorescenza per immagini la MT preparato con la miscela 1x OS. Per l'imaging L'UST preparato in questo modo, assicurarsi di utilizzare una eccitazione / emissione combinazione di filtri adatti per fluorescenza rodamina. Determinare la diluizione di lavoro ottimale per i filamenti singoli di imaging mediante ulteriori diluizioni MTS di 1 / 10 a 1 / 100 con tampone TUBI e imaging con mix 1x OS.
4. Preparare una camera di flusso da sandwich una grande (22 x 50 mm) e piccolo (22 x 22 mm) coprioggetto di vetro con due pezzi di nastro biadesivo messo 2-3 mm. Il nastro può essere facilmente tagliata a strisce mettendolo su un vetrino e il taglio con una lama di rasoio. Introdurre un microlitri alcuni di MTS nella cella di flusso utilizzando una micropipetta. Per l'imaging ad alto ingrandimento, obiettivi a lunga distanza di lavoro può essere richiesto per l'imaging della superficie superiore della camera di flusso. La distanza dal coprioggetto / superficie del campione alla superficie superiore della camera di flusso è determinata dallo spessore del nastro e dovrebbe essere 60-100 mm.

Modello MT mediante elettroforesi

1. Preparare una camera di elettroforesi mettendo due sottili strisce di nastro biadesivo in tutto il campione fantasia, SAM rivestite in modo che l'elettrodo è tra le strisce con il percorso di collegamento perpendicolari al nastro (Fig. 2). Posizionare il controelettrodo sul nastro biadesivo con la parte metallica tocca il nastro in modo che il bordo del campione sovrasta il controelettrodo di circa 3 mm (Fig. 2). Diverse lunghezze di taglio 15 cm di filo di rame isolato magnete e nastri 1 cm l'isolamento fuori di entrambe le estremità. Collegare un filo alla zona esposta Au del supporto con una piccola goccia di vernice argento avendo cura di evitare il contatto elettrico con il controelettrodo (questo può essere controllato con un multimetro). Collegare un secondo filo al controelettrodo con vernice argento. Fili attaccati con vernice argento può essere ulteriormente assicurata ai campioni con del nastro adesivo.
   
   Figura 2. Celle di assemblaggio di flusso per un microscopio invertito a fluorescenza. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 2.
2. Introdurre MTs alla diluizione desiderata utilizzando tampone TUBI combinato con OS a 1x concentrazione finale. Immagine a 20X di ingrandimento e individuare il motivo sul wafer di silicio prima di applicare una tensione. In alternativa, la camera di flusso può essere sigillati con smalto per evitare il flusso del fluido e la migrazione MT nel piano della camera di flusso.
3. Applicare una tensione fino a 1 V e osservare la migrazione di MTS. Tensioni più basse (fino a circa 0,5 V) possono essere utilizzati se cattura reversibile di MTS è desiderato, ma questo richiede di tenuta della camera di flusso per evitare la dispersione laterale. Smalto funziona bene per sigillare le estremità aperte della camera di flusso. A tensioni di sopra di circa 0,7 V, alcuni adesione MT può essere visto sul modello, anche se sarà debole. A tensioni di sopra di circa 0,9 V, la migrazione MT sarà più veloce, e l'adesione sarà più forte. Sopra circa 1,2 V la probabilità di indurre elettrolisi (formazione di bolle di gas) ed anche per distruggere il microelettrodi aumenta in modo significativo. La migrazione può essere rintracciato regolando il piano verticale di messa a fuoco del microscopio. Se eseguita correttamente, l'UST si localizza alle superfici degli elettrodi.

Discussion

La migrazione di MTS è facilmente visualizzabile usando la microscopia a fluorescenza per la loro luminosità e la fluorescenza di fondo basso. Il metodo è generalmente applicabile a patterning biomolecole, in quanto richiede solo che il biomolecole essere indotto a portare un onere netto di regolazione adeguata del pH del buffer. Elettroosmosi è evitato in questa configurazione perché non ci sono superfici di carico, come le pareti di silice utilizzata in elettroforesi capillare.

Diverse modifiche di questo metodo sono possibili. Sigillare le estremità della camera di flusso è fondamentale per osservare reversibilità perché l'evaporazione dalla estremità aperte cause del flusso di massa del liquido e la migrazione MT indesiderati. Ossidazione dei wafer di silicio prima di patterning litografico impedirà di conduzione attraverso il substrato, consentendo di elettrodi multipli con potenzialità indipendente per essere utilizzati contemporaneamente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[methoxypoly-(ethyleneoxy)propyl]-trimethoxysilane (PEG-silane)	Gelest Inc.	SIM6492.7	6-9 PEG units;molecular weight 450-600 g mol-1
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
Acetone	EMD Millipore	AX0120-8	ACS grade
Catalase	Calbiochem	219001-5MU
Chlorobenzene	EMD Millipore	MK441908	ACS grade
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)	Calbiochem	324626
Glucose	EMD Millipore	DX0145-1
Glucose oxidase	MP Biomedicals	100330
Guanosine-5’-[(α,Β)-methyleno]triphosphate, Sodium salt (GMPCPP)	Jena Biosciences, GmbH	NU-405s
Guanosine-5’-triphosphate	Sigma-Aldrich	G8752
Isopropanol	EMD Millipore	PX1835-5	ACS grade
Methyl isobutyl ketone (MIBK)	Fisher Scientific	AC12739-0010
Paclitaxel (taxol)	Calbiochem	580555
Piperazine-N,N’’-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Sigma-Aldrich	P1851
Polymethylmethacrylate (PMMA)	Brewer Science, Inc.	950K	molecular weight 950K
Rhodamine tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T331M	from bovine brain 99% pure, lyophilized
Toluene	EMD Millipore	TX0735-5	ACS grade
Tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T238	from bovine brain 99% pure, lyophilized
No. 1 borosilicate glass coverslips (22 X 50 mm) were purchased from VWR. Polished electronic grade p-type <111> silicon wafers were purchased from Addison Engineering, Inc. High-purity silver paint was obtained from Structure Probe, Inc. (Catalog # 5001 AB). Insulated fine gauge copper magnet wire (~ 0.08 mm (0.003”) diameter) can be obtained from electronic supply companies.