Murine भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से hematopoietic स्टेम सेल की व्युत्पत्ति
Summary
यह प्रोटोकॉल transplantable माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) और उनके lethally विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहों में बाद इंजेक्शन से hematopoietic स्टेम कोशिकाओं की व्युत्पत्ति विवरण. संक्षेप में, ईएससी embryoid निकायों, जो तब रेट्रोवायरल HoxB4 और OP9 stromal कोशिकाओं और hematopoietic साइटोकिन्स के साथ सह – सुसंस्कृत से संक्रमित कर रहे हैं के रूप में भेदभाव कर रहे हैं.
Abstract
एक स्टेम सेल क्षमता के साथ एक के लिए सेल के रूप में परिभाषित किया गया है दोनों आत्म नवीनीकृत और कई विभेदित संतान उत्पन्न. भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) जल्दी भ्रूण के ब्लास्टोसिस्ट से प्राप्त कर रहे हैं और differentiative क्षमता में pluripotent रहे हैं. उनके विशाल differentiative संभावित उन्हें बहुत कैसे उन्हें मनाना करने के लिए चिकित्सकीय उपयोगी सेल प्रकार उत्पन्न deducing पर केंद्रित शोध का ध्यान केंद्रित किया है. माउस ईएससी से hematopoietic स्टेम सेल HSC () के सफल व्युत्पत्ति हाल ही में पूरा किया गया है और इस वीडियो प्रोटोकॉल में visualized किया जा सकता है. HSC, यकीनन सबसे चिकित्सकीय शोषण सेल की आबादी, असंख्य hematopoietic दुर्दमताओं और विकारों के इलाज के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. हालांकि, कई रोगियों है कि HSC चिकित्सा से लाभ हो सकता है उपयुक्त दाताओं के लिए उपयोग की कमी है. ईएससी इन रोगियों के लिए एक HSC के वैकल्पिक स्रोत प्रदान कर सकता है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक आधारभूत जिसमें से ESC HSC और अध्ययन मानव ईएससी से HSC अलग करने के प्रयासों को सूचित किया जा सकता है स्थापित करता है. इस प्रोटोकॉल में, ईएससी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीरम के लिए पूर्व जांच इष्टतम hematopoietic भेदभाव में 6 दिनों के लिए embryoid निकायों (ईबीएस) के रूप में भेदभाव कर रहे हैं. ईबीएस तो dissociated और रेट्रोवायरल HoxB4 से संक्रमित हैं. चूहों, और hematopoiesis की उपस्थिति में दस दिनों के लिए साइटोकिन्स को बढ़ावा देने के सह सुसंस्कृत – संक्रमित EB-व्युत्पन्न कोशिकाओं OP9 stroma, एक अस्थि मज्जा stromal सेल एम-CSF / calvaria से व्युत्पन्न लाइन पर चढ़ाया जाता है. इस सह – संस्कृति के दौरान, संक्रमित कोशिकाओं को काफी विस्तार, पीढ़ी में कोशिकाओं के लाखों लोगों के 100s के एक विषम पूल परिणामस्वरूप. इन कोशिकाओं को तो बचाव और reconstitute lethally विकिरणित चूहों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice | Animal | Taconic Farm | ||
| Plate shaker | Tool | VWR | 33998-360 | Orbital Shaker by Ikaworks |
| Multi-channel pipettor | Tool | VWR | 15000-174 | ePet by BioHit |
| ES trypsin | Reagent | Invitrogen | 15090-046 | 0.25% Trypsin in PBS |
| Standard trypsin | Reagent | Invtrogen | 25300-062 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| PBS | Buffer | Invitrogen | 20012-027 | |
| Enzyme-free dissociation buffer | Buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Dissociation enzyme mix | Buffer | Invitrogen | 17104-019 | 500 mg Collagenase IV |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H2126 | freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing. |
| DNAse | Reagent | Sigma | D4527 | |
| DMEM | Invitrogen | 10-017CV | ||
| Protamine sulfate | Reagent | Sigma | P3369 | 8 ug/mL |
| EB differentiation media | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM+cytokines | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 20% anti-MEM | Please view recipe on attached Protocol.doc |
