マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出
Summary
このプロトコルの詳細マウス胚性幹細胞（ESC）と致死量の放射線照射、レシピエントマウスへの彼らのその後の注射から移植造血幹細胞の派生。簡単に言うと、ESCは、レトロウイルスHoxB4とOP9ストローマ細胞と造血サイトカインとの共培養に感染している胚様体、として区別されます。
Abstract
幹細胞は、両方の自己複製と生成する複数の分化した子孫の能力を持つ細胞として定義されています。胚性幹細胞（ESC）は、初期胚の胚盤胞に由来し、分化能力に多能性がありますされています。その広大な分化の可能性はそれらの臨床的に有用な細胞型を生成するために、それらを同軸にする方法推理を中心に多くの研究の焦点を行っています。マウスESCからの造血幹細胞（HSC）の成功導出は、最近行われており、このビデオのプロトコルで可視化することができます。 HSC、間違いなく最も臨床的に利用された細胞集団は、造血悪性腫瘍や疾患の無数の治療に使用されています。しかし、HSC治療の恩恵を受ける可能性がある多くの患者は、適切なドナーへのアクセスを欠いている。 ESCは、これらの患者のためのHSCの代替ソースを提供することができます。以下のプロトコルは、ESC – HSCの検討や人間のESCからHSCを分離するための努力を知らせることができるベースラインを確立します。このプロトコルでは、ESCは、市販の血清に対して事前にスクリーニングに最適な造血分化の6日間胚様体（EB）として区別されます。 EBはその後解離し、レトロウイルスHoxB4に感染している。マウス、および10日間のサイトカインを促進する造血の存在下で共培養 – 感染したEB由来細胞はOP9ストローマ、M – CSF – /の頭蓋冠由来する骨髄間質細胞株上にプレーされています。この共培養時には、感染細胞は、世代内のセルの数百万数百の異種プールを結果として、大幅に拡大する。これらの細胞は、致死量放射線照射したマウスを救出して再構成するために使用することができます。
Protocol
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice | Animal | Taconic Farm | ||
| Plate shaker | Tool | VWR | 33998-360 | Orbital Shaker by Ikaworks |
| Multi-channel pipettor | Tool | VWR | 15000-174 | ePet by BioHit |
| ES trypsin | Reagent | Invitrogen | 15090-046 | 0.25% Trypsin in PBS |
| Standard trypsin | Reagent | Invtrogen | 25300-062 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| PBS | Buffer | Invitrogen | 20012-027 | |
| Enzyme-free dissociation buffer | Buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Dissociation enzyme mix | Buffer | Invitrogen | 17104-019 | 500 mg Collagenase IV |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H2126 | freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing. |
| DNAse | Reagent | Sigma | D4527 | |
| DMEM | Invitrogen | 10-017CV | ||
| Protamine sulfate | Reagent | Sigma | P3369 | 8 ug/mL |
| EB differentiation media | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM+cytokines | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 20% anti-MEM | Please view recipe on attached Protocol.doc |
