Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini
Summary
Questa dettagli del protocollo la derivazione di cellule staminali ematopoietiche trapiantabili da topo cellule staminali embrionali (ESC) e la loro successiva iniezione in topi irradiati letalmente destinatario. In breve, ESC si differenziano come corpi embrionali, che sono poi infettati con HoxB4 retrovirali e co-coltura con cellule stromali OP9 e citochine ematopoietiche.
Abstract
Una cellula staminale è definito come una cella con la capacità di entrambe le auto-rinnovarsi e di generare più progenie differenziata. Le cellule staminali embrionali (ESC) sono derivate dalla blastocisti dell'embrione precoce e sono pluripotenti in grado differenziativo. Il loro potenziale differenziativo vasta li ha resi oggetto di ricerche molto centrata sulla dedurre il modo di convincere loro di generare tipi di cellule clinicamente utili. La derivazione di successo di cellule staminali ematopoietiche (HSC) da topo CES è stato recentemente compiuto e possono essere visualizzati in questo protocollo video. HSC, probabilmente la popolazione di cellule clinicamente più sfruttati, sono usati per trattare una miriade di tumori ematopoietici e disturbi. Tuttavia, molti pazienti che potrebbero trarre beneficio dalla terapia HSC non hanno accesso ai donatori idonei. ESC potrebbe fornire una fonte alternativa di HSC per questi pazienti. Il seguente protocollo stabilisce una linea di base da cui ESC-HSC possono essere studiati e informare gli sforzi per isolare da HSC umane ESC. In questo protocollo, ESC si differenziano come corpi embrionali (EBS) per 6 giorni nel commercio sierici pre-screening per la differenziazione ottimale ematopoietiche. EBS sono dissociati e poi infettati con HoxB4 retrovirali. Infetti EB cellule derivate sono placcati in OP9 stroma, un stromali del midollo osseo linea cellulare deriva dalla calvaria di M-CSF-/ – topi, e co-coltura in presenza di ematopoiesi promuovere citochine per dieci giorni. Durante questo co-coltura, le cellule infette espandere notevolmente e si traducono nella generazione un pool eterogeneo di 100s di milioni di cellule. Queste cellule possono quindi essere utilizzati per topi salvataggio e ricostituire letale irradiati.
Protocol
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice | Animal | Taconic Farm | ||
| Plate shaker | Tool | VWR | 33998-360 | Orbital Shaker by Ikaworks |
| Multi-channel pipettor | Tool | VWR | 15000-174 | ePet by BioHit |
| ES trypsin | Reagent | Invitrogen | 15090-046 | 0.25% Trypsin in PBS |
| Standard trypsin | Reagent | Invtrogen | 25300-062 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| PBS | Buffer | Invitrogen | 20012-027 | |
| Enzyme-free dissociation buffer | Buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Dissociation enzyme mix | Buffer | Invitrogen | 17104-019 | 500 mg Collagenase IV |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H2126 | freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing. |
| DNAse | Reagent | Sigma | D4527 | |
| DMEM | Invitrogen | 10-017CV | ||
| Protamine sulfate | Reagent | Sigma | P3369 | 8 ug/mL |
| EB differentiation media | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM+cytokines | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 20% anti-MEM | Please view recipe on attached Protocol.doc |
