Questa dettagli del protocollo la derivazione di cellule staminali ematopoietiche trapiantabili da topo cellule staminali embrionali (ESC) e la loro successiva iniezione in topi irradiati letalmente destinatario. In breve, ESC si differenziano come corpi embrionali, che sono poi infettati con HoxB4 retrovirali e co-coltura con cellule stromali OP9 e citochine ematopoietiche.
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Articolo metodologico
Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una cellula staminale è definito come una cella con la capacità di entrambe le auto-rinnovarsi e di generare più progenie differenziata. Le cellule staminali embrionali (ESC) sono derivate dalla blastocisti dell'embrione precoce e sono pluripotenti in grado differenziativo. Il loro potenziale differenziativo vasta li ha resi oggetto di ricerche molto centrata sulla dedurre il modo di convincere loro di generare tipi di cellule clinicamente utili. La derivazione di successo di cellule staminali ematopoietiche (HSC) da topo CES è stato recentemente compiuto e possono essere visualizzati in questo protocollo video. HSC, probabilmente la popolazione di cellule clinicamente più sfruttati, sono usati per trattare una miriade di tumori ematopoietici e disturbi. Tuttavia, molti pazienti che potrebbero trarre beneficio dalla terapia HSC non hanno accesso ai donatori idonei. ESC potrebbe fornire una fonte alternativa di HSC per questi pazienti. Il seguente protocollo stabilisce una linea di base da cui ESC-HSC possono essere studiati e informare gli sforzi per isolare da HSC umane ESC. In questo protocollo, ESC si differenziano come corpi embrionali (EBS) per 6 giorni nel commercio sierici pre-screening per la differenziazione ottimale ematopoietiche. EBS sono dissociati e poi infettati con HoxB4 retrovirali. Infetti EB cellule derivate sono placcati in OP9 stroma, un stromali del midollo osseo linea cellulare deriva dalla calvaria di M-CSF-/ - topi, e co-coltura in presenza di ematopoiesi promuovere citochine per dieci giorni. Durante questo co-coltura, le cellule infette espandere notevolmente e si traducono nella generazione un pool eterogeneo di 100s di milioni di cellule. Queste cellule possono quindi essere utilizzati per topi salvataggio e ricostituire letale irradiati.
Protocollo
Differenziazione delle cellule staminali embrionali
- Raccogliere un pallone vicino confluenti di cellule staminali embrionali (ESC) tramite trattamento con tripsina ESC.
- Risospendere le cellule in 5 ml di mezzi di differenziazione e trasferimento in un non-gelatina rivestito T25. Incubare a 37 ° C per 45 minuti. Recuperare il surnatante e raccogliere le cellule tramite centrifugazione.
Nota: fibroblasti embrionali di topo (MEF) dalle culture CES collegare facilmente al non-gelatina rivestito T25 e quindi sono esaurite dalla cultura in questa fase placcatura. Se non sei coltura tuo ESC MEF, è possibile saltare il pre-piastra.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Topi C57Bl/6 deficienti per Rag-2/gamma-c | Animale | Taconic Farm | ||
| Agitatore per piastre | Strumento | VWR international | 33998-360 | Agitatore orbitale di Ikaworks |
| Pipetta multicanale | Strumento | VWR international | 15000-174 | ePet di BioHit |
| Tripsina ES | Reagente | Invitrogen | 15090-046 | Tripsina 0,25% in PBS |
| Tripsina standard | Reagente | Invitrogen | 25300-062 | Tripsina-EDTA 0,05% |
| PBS | Tampone | Invitrogen | 20012-027 | |
| Tampone di dissociazione senza enzimi | Tampone | Invitrogen | 13151-014 | |
| Miscela enzimatica di dissociazione | Tampone | Invitrogen | 17104-019 | 500 mg di Collagenasi IV |
| Ialuronidasi | Reagente | Sigma-Aldrich | H2126 | congelare in aliquote da 500 μL ed evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. |
| DNAasi | Reagente | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| DMEM | Invitrogen | 10-017CV | ||
| Solfato di protamina | Reagente | Sigma-Aldrich | P3369 | 8 μg/mL |
| Mezzo di differenziamento EB | mezzo | Consultare la ricetta nel file Protocol.doc allegato | ||
| IMDM 10% | mezzo | Consultare la ricetta nel file Protocol.doc allegato | ||
| IMDM 10% + citochine | mezzo | Consultare la ricetta nel file Protocol.doc allegato | ||
| anti-MEM 20% | Consultare la ricetta nel file Protocol.doc allegato |
Ristampe e permessi
