Этот протокол детали вывода трансплантации гемопоэтических стволовых клеток из мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и их последующей закачки в смертельно облученных мышей получателя. Короче говоря, ЭСК дифференцируются эмбриоидных органов, которые затем инфицированных ретровирусных HoxB4 и со-культивировали с OP9 стромальные клетки и гемопоэтические цитокины.
Abstract
Стволовых клеток определяется как клетка с возможностью как самостоятельного обновления и создавать несколько дифференцированных потомства. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) получают из бластоцист из раннего эмбриона и плюрипотентные в differentiative способности. Их огромный потенциал differentiative сделало их центром внимания для большого исследования сосредоточены на выведении как уговорить их для создания клинически полезным типов клеток. Успешный вывод гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) из мышиных ЭСК было недавно достигнуто, и могут быть визуализированы в этом видео протокол. HSC, пожалуй, наиболее клинически эксплуатируемые популяции клеток, которые используются для лечения множества злокачественных опухолей кроветворной и расстройств. Тем не менее, многие пациенты, которые могли бы извлечь выгоду из HSC терапии не имеют доступа к подходящих доноров. ESC может обеспечить альтернативный источник HSC для этих пациентов. Следующий протокол устанавливает исходных линий, от которых ESC-HSC можно изучать и в усилиях по изоляции HSC из человеческих ЭСК. В этом протоколе, ESC, дифференцируются как эмбриоидных тел (ЭТ) в течение 6 дней в коммерчески доступных сыворотки предварительно отобранных для оптимального гемопоэтических дифференциации. ЭТ затем диссоциирован и инфицированных ретровирусных HoxB4. Зараженные EB-клеток, полученных из высевали на OP9 стромы, стромы костного мозга клеточной линии происходит от черепа М-CSF-/ – мышей, и ко-культивировали в присутствии органов кроветворения содействия цитокинов в течение десяти дней. Во время этого совместного культуры, инфицированных клеток значительно расширить, в результате чего поколения гетерогенных пул 100s из миллионов клеток. Эти клетки затем можно использовать, чтобы спасти и восстановить смертельно облученных мышей.
Protocol
Дифференциация эмбриональных стволовых клеток Сбор возле сливающийся колбу эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) с помощью лечения ESC трипсина. Ресуспендируют клетки в 5 мл Дифференциация средств массовой информации и передачи не-желатин покрытием T25. Инкубировать при 37 ° С ?…
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice
Animal
Taconic Farm
Plate shaker
Tool
VWR
33998-360
Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor
Tool
VWR
15000-174
ePet by BioHit
ES trypsin
Reagent
Invitrogen
15090-046
0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin
Reagent
Invtrogen
25300-062
0.05% Trypsin-EDTA
PBS
Buffer
Invitrogen
20012-027
Enzyme-free dissociation buffer
Buffer
Invitrogen
13151-014
Dissociation enzyme mix
Buffer
Invitrogen
17104-019
500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase
Reagent
Sigma
H2126
freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.