Härledning av hematopoetiska stamceller från Murine embryonala stamceller
Summary
Detta protokoll detaljer härledning av transplanterbara hematopoetiska stamceller från mus embryonala stamceller (ESC) och den efterföljande injektion i dödligt bestrålade mottagaren möss. Kortfattat är ESC differentierade som embryoid organ, som sedan är infekterade med retrovirus HoxB4 och co-odlade med OP9 stromaceller och hematopoetisk cytokiner.
Abstract
En stamcell definieras som en cell med förmåga att både själv förnya och generera flera differentierade avkomma. Embryonala stamceller (ESC) kommer från blastocysten av de tidiga embryot och är pluripotenta i differentiative förmåga. Deras enorma differentiative potential har gjort dem i fokus för mycket forskning inriktade på att kunna utläsa hur man lirka dem att generera kliniskt användbara celltyper. Den framgångsrika härledning av hematopoetiska stamceller (HSC) från mus ESK har nyligen gjorts och kan visualiseras i denna video protokoll. HSC, utan tvekan den mest kliniskt exploaterade cellpopulation, används för att behandla en myriad av hematopoetisk maligniteter och störningar. Men många patienter som kan dra nytta av HSC terapi saknar tillgång till lämpliga givare. ESK skulle kunna utgöra en alternativ källa av HSC för dessa patienter. Följande protokoll upprättas en baslinje från vilken ESC-HSC kan studeras och informera ansträngningar att isolera HSC från mänsklig ESC. I detta protokoll är ESC differentierade som embryoid organ (EBS) i 6 dagar i kommersiellt tillgängliga serum förhandsgranskas för optimal hematopoetisk differentiering. EB är sedan dissocierade och infekterade med retrovirus HoxB4. Infekterade EB-härledda celler är pläterade på OP9 glatta en benmärg stromaceller cellinje härstammar från calvaria av M-CSF-/ – möss, och co-odlade i närvaro av blodbildningen främja cytokiner i tio dagar. Under denna co-kultur, de infekterade cellerna expanderar kraftigt, vilket resulterar i generationen en heterogen grupp av 100s miljontals celler. Dessa celler kan sedan användas för att rädda och återupprätta dödligt bestrålade möss.
Protocol
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice | Animal | Taconic Farm | ||
| Plate shaker | Tool | VWR | 33998-360 | Orbital Shaker by Ikaworks |
| Multi-channel pipettor | Tool | VWR | 15000-174 | ePet by BioHit |
| ES trypsin | Reagent | Invitrogen | 15090-046 | 0.25% Trypsin in PBS |
| Standard trypsin | Reagent | Invtrogen | 25300-062 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| PBS | Buffer | Invitrogen | 20012-027 | |
| Enzyme-free dissociation buffer | Buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Dissociation enzyme mix | Buffer | Invitrogen | 17104-019 | 500 mg Collagenase IV |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H2126 | freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing. |
| DNAse | Reagent | Sigma | D4527 | |
| DMEM | Invitrogen | 10-017CV | ||
| Protamine sulfate | Reagent | Sigma | P3369 | 8 ug/mL |
| EB differentiation media | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM+cytokines | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 20% anti-MEM | Please view recipe on attached Protocol.doc |
