Linearisierung der Bradford Protein Assay
Summary
Die Genauigkeit und Empfindlichkeit der Protein-Bestimmung durch die schnelle und bequeme Bradford Assay wird durch intrinsische Nichtlinearität beeinträchtigt. Wir zeigen eine einfache Linearisierung Verfahren, das erhöht die Genauigkeit, verbessert die Sensitivität des Tests zu 10-fach, und reduziert Störungen durch Reinigungsmittel.
Abstract
Bestimmung von Mikrogramm-Mengen des Proteins in der Bradford Coomassie Brilliant Blue Assay wird durch Messung der Absorption bei 590 nm erreicht. Das häufigste Assay ermöglicht die schnelle und einfache Proteinquantifizierung in Zelllysaten, Zellfraktionen oder rekombinantes Protein-Proben, zum Zweck der Normalisierung der biochemischen Messungen. Doch Kompromisse eine intrinsische Nichtlinearität der Empfindlichkeit und Genauigkeit dieser Methode. Es wird gezeigt, dass unter normalen Testbedingungen, das Verhältnis der Absorptionsmessungen bei 590 nm und 450 nm streng linear mit Protein-Konzentration ist. Dieses einfache Verfahren erhöht die Genauigkeit und verbessert die Sensitivität des Tests zu 10-fach, erlauben die Quantifizierung bis zu 50 ng Rinderserumalbumin. Darüber hinaus ist die Störung häufig von Reinigungsmitteln verwendet werden, um den Zelllysaten erstellen eingeführt stark durch das neue Protokoll reduziert. Eine lineare Gleichung auf der Basis von Massenaktionen und Beer-Gesetz entwickelt passt perfekt zu den experimentellen Daten.
Protocol
Discussion
Die Bradford-Protein-Assay ist beliebt wegen seiner einfachen Leistung und relative Empfindlichkeit. Die Linearisierung über den gesamten Protein-Konzentrationen Bereich durch das Protokoll erhalten hier vorgestellten weiter vereinfacht den Test, wie die unbekannten Proben müssen sich nicht innerhalb des Bereiches der Eichkurve fallen.
Wichtig ist, dass die verbesserte Protokoll weiteren bietet die folgenden Vorteile gegenüber dem ursprünglichen Bradford-Protokoll:
- Erhöhte …
Acknowledgements
Dieses Papier ist dem Andenken des verstorbenen Dr. Zvi Selinger, der das Original hier beschriebenen Untersuchungen gehostet gewidmet.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bradford reagent | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 | ||
| Bovine Serum Albumin | Amersco | 0332 | ||
| Multiplate absorbance reader | BioTek | Synergy2 |
References
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G. Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).
- Chial, H. J., Splittgerber, A. G. A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH. Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
- Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. The binding interaction of Coomassie blue with proteins. Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).
- Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).
