Linealización del ensayo de proteínas Bradford
Summary
La precisión y la sensibilidad de la determinación de proteínas mediante el ensayo de Bradford rápida y conveniente se ve comprometida por la no linealidad intrínseca. Se muestra un procedimiento de linealización simple que aumenta en gran medida la precisión, mejora la sensibilidad de la prueba unas 10 veces, y reduce significativamente la interferencia de los detergentes.
Abstract
Determinación de las cantidades de microgramos de proteína en el ensayo de Bradford azul brillante de Coomassie se lleva a cabo mediante la medición de la absorbancia a 590 nm. Este ensayo más común permite la cuantificación de proteínas rápida y sencilla en lisados de células, las fracciones celulares, o muestras de proteínas recombinantes, con el propósito de la normalización de las mediciones bioquímicas. Sin embargo, una no-linealidad intrínseca compromete la sensibilidad y la precisión de este método. Se demuestra que bajo condiciones de ensayo estándar, la proporción de las mediciones de absorbancia a 590 nm y 450 nm es estrictamente lineal con la concentración de proteínas. Este sencillo procedimiento aumenta la precisión y mejora la sensibilidad de la prueba unas 10 veces, permitiendo la cuantificación de hasta 50 ng de albúmina sérica bovina. Además, la interferencia común introducido por los detergentes que se utilizan para crear los lisados celulares se reduce considerablemente por el nuevo protocolo. Una ecuación lineal desarrollado sobre la base de la acción de masas y la ley de Beer se adapta perfectamente a los datos experimentales.
Protocol
Discussion
El ensayo de proteínas Bradford es muy popular debido a su facilidad de realización y la sensibilidad relativa. La linealización sobre las concentraciones de proteína completa gama que se obtenga el protocolo que aquí se presenta simplifica aún más el ensayo, ya que las muestras desconocidas no tiene que estar dentro del rango de la curva de calibración.
Es importante destacar que el protocolo mejorado aún ofrece las siguientes ventajas sobre el protocolo original de Bradford:
<…Acknowledgements
Este trabajo está dedicado a la memoria del fallecido Dr. Zvi Selinger, que fue sede de la investigación original se describe aquí.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bradford reagent | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 | ||
| Bovine Serum Albumin | Amersco | 0332 | ||
| Multiplate absorbance reader | BioTek | Synergy2 |
References
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