Linjärisering av Bradford Protein-analys
Summary
Noggrannheten och känslighet av protein bestämning genom den snabba och bekväma Bradford analys äventyras av inneboende olinjäritet. Vi visar en enkel linjärisering förfarande som kraftigt ökar noggrannheten, förbättrar känsligheten i analysen ungefär 10-faldig, och minskar störningar av rengöringsmedel.
Abstract
Fastställande av mikrogram mängder protein i Bradford Coomassie lysande blå analys sker genom mätning av absorbansen vid 590 nm. Det vanligaste analys möjliggör snabb och enkel protein kvantifiering i cell lysates, cellfraktioner, eller rekombinant prover protein, i syfte att normalisering av biokemiska mätningar. Men kompromisser en inneboende olinjäritet känslighet och precision med denna metod. Det är visat att under vanliga analys villkor, är förhållandet mellan absorbansen mätningar vid 590 nm och 450 nm strikt linjär med protein koncentration. Detta enkla förfarande ökar noggrannheten och förbättrar känsligheten i analysen ungefär 10-faldig, tillåter kvantifiering ner till 50 ng bovint serumalbumin. Dessutom är störningen vanligtvis införts genom rengöringsmedel som används för att skapa cellen lysates kraftigt minskas med det nya protokollet. En linjär ekvation utvecklades på grundval av massaktioner och öl lag passar perfekt i experimentella data.
Protocol
Discussion
The Bradford protein-analysen är populär tack vare sin lätthet av prestanda och relativ känslighet. Den linjärisering över hela proteinet koncentrationer intervall som protokollet presenteras här ytterligare förenklar analysen, eftersom okända prover behöver inte faller inom intervallet för kalibreringskurvan.
Viktigt ger förbättrade protokollet vidare följande fördelar jämfört med den ursprungliga Bradford protokoll:
- Ökad noggrannhet.
- Känsligheten ?…
Acknowledgements
Denna uppsats är tillägnad minnet av den framlidne Dr Zvi Selinger, som var värd den ursprungliga forskningen beskrivs här.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bradford reagent | Bio-Rad Laboratories | 500-0006 | ||
| Bovine Serum Albumin | Amersco | 0332 | ||
| Multiplate absorbance reader | BioTek | Synergy2 |
References
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G. Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).
- Chial, H. J., Splittgerber, A. G. A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH. Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
- Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. The binding interaction of Coomassie blue with proteins. Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).
- Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).
