Noggrannheten och känslighet av protein bestämning genom den snabba och bekväma Bradford analys äventyras av inneboende olinjäritet. Vi visar en enkel linjärisering förfarande som kraftigt ökar noggrannheten, förbättrar känsligheten i analysen ungefär 10-faldig, och minskar störningar av rengöringsmedel.
Abstract
Fastställande av mikrogram mängder protein i Bradford Coomassie lysande blå analys sker genom mätning av absorbansen vid 590 nm. Det vanligaste analys möjliggör snabb och enkel protein kvantifiering i cell lysates, cellfraktioner, eller rekombinant prover protein, i syfte att normalisering av biokemiska mätningar. Men kompromisser en inneboende olinjäritet känslighet och precision med denna metod. Det är visat att under vanliga analys villkor, är förhållandet mellan absorbansen mätningar vid 590 nm och 450 nm strikt linjär med protein koncentration. Detta enkla förfarande ökar noggrannheten och förbättrar känsligheten i analysen ungefär 10-faldig, tillåter kvantifiering ner till 50 ng bovint serumalbumin. Dessutom är störningen vanligtvis införts genom rengöringsmedel som används för att skapa cellen lysates kraftigt minskas med det nya protokollet. En linjär ekvation utvecklades på grundval av massaktioner och öl lag passar perfekt i experimentella data.
Protocol
Linjärisering av Bradford Protein kalibreringskurvan: Den Coomassie lysande blå protein analys, känd som Bradford analys 1, används ofta på grund av dess snabba och bekväma protokoll samt dess relativa känslighet. Tyvärr finns det ett stort mått av krökning över ett brett spektrum av protein koncentrationer (Fig. 1). Därför är endast en liten del av relativt hög proteinhalt koncentrationer, 2-10 mg / ml BSA, som används för kalibreringskurvan, som då bättre passar…
Discussion
The Bradford protein-analysen är populär tack vare sin lätthet av prestanda och relativ känslighet. Den linjärisering över hela proteinet koncentrationer intervall som protokollet presenteras här ytterligare förenklar analysen, eftersom okända prover behöver inte faller inom intervallet för kalibreringskurvan.
Viktigt ger förbättrade protokollet vidare följande fördelar jämfört med den ursprungliga Bradford protokoll:
Ökad noggrannhet.
Känsligheten ?…
Acknowledgements
Denna uppsats är tillägnad minnet av den framlidne Dr Zvi Selinger, som var värd den ursprungliga forskningen beskrivs här.