Summary
Здесь мы представляем первый протокол локализованной вакуумной инфильтрации для исследований in vivo генетической трансформации крупномерных растений. Используя эту методологию, мы впервые добились Agrobacterium-опосредованной в planta транзиторной трансформации какао.
Abstract
Переходная трансформация растений является быстрой и экономичной альтернативой генетической трансформации растений. Большинство протоколов трансформации in planta основаны на использовании трансформации, опосредованной агробактериями. Тем не менее, используемые в настоящее время протоколы стандартизированы для малогабаритных установок из-за физических и экономических ограничений, связанных с вакуумной обработкой крупногабаритных установок. В данной работе представлен эффективный протокол локализованной вакуумной агроинфильтрации, адаптированный для крупнокалиберных растений. Для оценки эффективности предложенного метода мы протестировали его применение на растениях какао – тропическом виде растений, невосприимчивом к генетической трансформации. Наш протокол позволял применять вакуум до 0,07 МПа, с повторениями, к локализованной надземной части листьев какао, что позволяло форсировать инфильтрацию Agrobacterium в межклеточные пространства прикрепленных листьев. В результате мы добились Agrobacterium-опосредованной транзиентной трансформации planta прикрепленных листьев какао, экспрессирующей для репортерной системы RUBY. Это также первый случай транзиторной трансформации какао, опосредованный агробактериями. Этот протокол позволит применить метод вакуумной агроинфильтрации к другим видам растений с аналогичными размерными ограничениями и откроет дверь для характеристики генов in planta у непокорных древесных крупноразмерных видов.
Introduction
Методы генетической трансформации растений имеют важное значение для проверки биологических функций генов и особенно полезны сегодня, учитывая большое количество неохарактеризованных генов, предсказанных в постгеномнуюэпоху. Эти методы могут быть использованы для получения полностью трансформированных линий или для экспрессии генов на переходной основе. Стабильная трансформация происходит, когда чужеродная ДНК, принятая хозяином, полностью и необратимо интегрируется в геном хозяина, и генетические модификации передаются последующим поколениям. Транзиторная экспрессия, известная как транзиторная трансформация, происходит из нескольких копий Т-ДНК, перенесенных агробактериями в клетку, которые не были интегрированы в геном хозяина, и достигает пика через 2-4 дняпосле заражения.
Стоит отметить, что анализы транзиторной экспрессии часто достаточны для функциональной характеристики генов и могут предложить ряд преимуществ по сравнению со стабильной трансформацией. Например, транзиторная трансформация не требует процедур регенерации на основе культуры тканей. Еще одно преимущество заключается в том, что он совместим с функциональным анализом генов in planta , существующим несколькими успешными примерами протоколов, хорошо стандартизированных для модельных видов растений, таких как Arabidopsis thaliana3 и Nicotiana benthamiana4, но все еще ограниченных для немодельных видов5.
Развитие транзиторных анализов зависит от наличия эффективных методов переноса генов. Для этого наиболее популярные подходы основаны на инфильтрации Agrobacterium , которая использует уникальную способность Agrobacterium переносить ДНК в клетки растений6. Другим полезным инструментом для такого анализа является использование репортерных генов, таких как зеленые флуоресцентные белки (GFP), β-глюкуронидаза (GUS), люцифераза или RUBY, которые используются для отслеживания трансформационных событий. Среди этих репортерных систем RUBY в настоящее время является самой простой для визуализации и основана на превращении тирозина в беталаины посредством трех ферментативных реакций. В отличие от других репортерных систем, полученные беталаины можно легко наблюдать в виде ярко окрашенных пигментов на трансформированных растительных тканях без необходимости использования сложного оборудования или дополнительных реагентов7.
При инфильтрации суспензии Agrobacterium в межклеточное пространство мезофилла листа наиболее критическим этапом для успешной агроинфекции является преодоление физического барьера, накладываемого эпидермальной кутикулой листьев8. В то время как для некоторых растений градиент давления, создаваемый безыгольным шприцем (шприцевая агроинфильтрация), достаточен для эффективной агроинфильтрации, как это происходит у Nicotiana benthamiana9, другим видам растений может потребоваться больший градиент давления, например, тот, который создается с помощью вакуумных насосов10. При вакуумных процессах агроинфильтрация происходит в два этапа. В первом случае вакуум служит для того, чтобы подвергнуть растительный материал пониженному давлению, заставляя выделять газы из воздушных пространств мезофилла через устьица и раны. Затем, во время фазы регерметизации, суспензия Agrobacterium проникает в межклеточные пространства через устьица и ранит11.
По сравнению с инфильтрацией шприцем, вакуумная инфильтрация обеспечивает более высокую частоту использования, воспроизводимость и возможность контролировать давление и продолжительность на каждом этапе процесса инфильтрации10. В листьях различных видов растений, таких как шпинат (Spinacia oleracea)12, пион (древесный многолетник) (Paeonia ostii)13 и вигна (Vigna unguiculata)14, протоколы вакуумной агроинфильтрации достигали более высокой скорости инфильтрации, чем инфильтрация шприцем. Аналогичным образом, у томатов (Lycopersicon esculentum)15 и гербер (Gerbera hybrida)16 вакуумная агроинфильтрация приводила к более сильному и равномерному подавлению генов, чем шприцевая инфильтрация. Дополнительным преимуществом вакуумной инфильтрации является меньшая зависимость от генотипа по сравнению со шприцевой инфильтрацией, которая недавно наблюдалась у трех сортов цитрусовых (Fortunella obovata, Citrus limon и C. grandis)17. Однако при попытке применить вакуумную агроинфильтрацию к растениям, которые слишком велики, чтобы поместиться в эксикаторы, размер вакуумных камер может быть ограничением, как это обычно происходит с тропическими древесными растениями.
Ниже мы опишем протокол, который преодолевает пространственные ограничения вакуумных камер, проверяя его полезность для переходной трансформации листьев какао in planta . Мы представляем первый локализованный метод вакуумной инфильтрации какао, который не требует дополнительного оборудования и даже позволяет использовать те же лабораторные эксикаторы, что и для инфильтрации всего растения, но с простой адаптацией, позволяющей получить доступ к части растения внутри вакуумной камеры, что позволяет использовать его на разных стадиях развития растения. Чтобы проверить полезность предложенного метода локализованной вакуумной инфильтрации, мы выбрали какао в качестве аналога крупнолистного тропического вида растений, который трудно трансформировать. Используя этот метод локализованной инфильтрации, мы недавно сообщили о первой транзиторной экспрессии растений в авокадо путем вакуумной инфильтрации, опосредованной агробактериями, с условиями, ранее оптимизированными для отделившихся листьев18, и здесь мы сообщаем о первой транзиторной экспрессии в planta у какао.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура Agrobacterium tumefaciens
- Размораживание электрокомпетентных клеток штамма Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
- Добавьте 1 мл дрожжевого солода (YM; Таблица 1) бульон в культуральную пробирку размером 17 мм х 100 мм. Сохраните эту пробирку на потом и храните при комнатной температуре (RT).
- В пробирку с микрофугой объемом 1,5 мл добавляют 30 мкл размороженных клеток Agrobacterium и 100-250 нг (до 5 мкл) ДНК, содержащей 35S:RUBY. Аккуратно перемешайте.
ПРИМЕЧАНИЕ: 35S:RUBY был подарком от Юньдэ Чжао. Чтобы избежать возникновения дуги в образце, максимально уменьшите присутствие ионных соединений. Эти ионные соединения могут быть остаточными солями, образующимися в результате осаждения этанолом ДНК19. - На этом этапе поместите на лед электропорационную кювету диаметром 1 мм.
- Перелейте предыдущую суспензионную смесь в охлажденную кювету для электропорации диаметром 1 мм. Держите все на льду. Протрите металлические электроды кюветы.
- Установите электропоратор на Agr (2,2 кВ, ~5 мс, 1 импульс). Поместите кювету внутрь электропорационной камеры.
- Нажмите кнопку Pulse . Зарегистрируйте параметры импульса. Если на образце вспыхнула дуга, процесс электропорации не удался.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно быстро перенести клетки в бульон YM сразу после импульса. Отсрочка этого переноса может резко снизить эффективность преобразования20. - Немедленно используйте сэкономленный бульон YM для переноса клеток из кюветы в пробирку размером 17 мм x 100 мм. Аккуратно ресуспендируйте клетки.
- Инкубируют трансформированные клетки в течение 3 ч при 28 °C и 250 об/мин на орбитальном инкубаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта культура не содержит антибиотиков; Будьте осторожны с надлежащими асептическими условиями. - Нанесите эту культуру на селективные агаровые пластины YM21. Для трансформированного штамма LBA4404-RUBY убедитесь, что эти планшеты содержат рифампицин (25 мкг/мл), спектиномицин (50 мкг/мл) и стрептомицин (50 мкг/мл). Инкубируйте эту пластину в течение ночи в инкубаторе со стоячей температурой 28 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовался вектор 35S:RUBY , который придает устойчивость бактерий к спектиномицину (50 мкг/мл) и функционирует как визуальный репортер на инфильтрированных растительных тканях. - Высевают колонии из ночной культуры на 12,5 мл смеси отвара YM и бульона Luria Bertani (LB) (в пропорции 9:1 соответственно), 10 мМ MES, pH 5,722. Убедитесь, что эта селективная жидкая среда содержит те же антибиотики, которые использовались на шаге 1.10. В таблице 1 приведены ингредиенты и концентрации этих сред.
- При инкубации агробактерий оставьте для культуры достаточно места для аэрации, примерно в 4-5 раз превышающее объем жидкости. Используйте отвар YM для LBA4404 штамма Agrobacterium , чтобы избежать слипания клеток23.
- Инкубируют культуру в течение 16 ч при 250 об/мин на орбитальном инкубаторе с температурой 28 °C.
- Увеличьте культуру до 10 раз по сравнению с исходным объемом с помощью той же среды, которая использовалась на шаге 1.11.
- Инкубируют культуру в течение 16 ч при 250 об/мин на орбитальном инкубаторе с температурой 28 °C.
- Отрегулируйте ночную культуру до оптической плотности (OD600), равной 0,4. Добавьте 20 мкМ ацетосирингона (АС).
- Инкубируйте при 250 об/мин на орбитальном инкубаторе с температурой 28 °C, пока наружный диаметр600 не достигнет примерно 1,0.
- Центрифугируют клетки при 4 500 x g в течение 10 мин при 20 °C.
- Ресуспендируйте гранулы с помощью суспензионного раствора (10 мМ MES, 10 мМ MgCl2, pH 5,7), регулируя наружный диаметр600 до 0,6. Добавьте 200 мкМ AS24.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно инкубируйте раствор суспензии при температуре 28 °C. Если суспензионный раствор при добавлении холодный, клетки выпадут в осадок. - Оставьте бактериальную суспензию на 2-24 ч в темных условиях и при температуре 25 °C. Агитация не требуется22.
2. Выбор растения
- Выбирайте растение с веткой с листьями в оптимальной стадии для агроинфильтрации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Растение может быть взрослым или взрослым деревом. Для какао рекомендуются молодые листья стадии С. Эти листья имеют бронзовый или светло-зеленый цвет; они не полностью расширены и не так жестки, как листьястадии D 25 (рис. 1).- В качестве контроля одновременно проводят агроинфильтрацию на других растениях (например, Nicotiana tabacum) с высокой эффективностью агроинфильтрации, которая сообщается для используемого штамма и переносчика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если в этом контроле не получено положительных результатов, возможно, отрицательные результаты связаны с деформацией или используемым вектором.
- В качестве контроля одновременно проводят агроинфильтрацию на других растениях (например, Nicotiana tabacum) с высокой эффективностью агроинфильтрации, которая сообщается для используемого штамма и переносчика.
3. Настройка вакуумной камеры
- В качестве вакуумной камеры используйте эксикатор с вакуумметром для измерения вакуумного давления внутри.
- Добавьте 250 мкМ жасмоновой кислоты (JA)18,26 к суспензии Agrobacterium, начиная с шага 1.19.
- Перенесите культуру Agrobacterium в стакан с широким горлышком, чтобы погрузить выбранную ветку и листья. Затем поместите стакан с культурой Agrobacterium внутрь эксикатора.
- Поместите ветку между эксикатором и его крышкой. Обязательно погрузите желаемые листья внутрь культуры Agrobacterium . Далее используют прыгающее кольцо, которое представляет собой круглое кольцо с вырезом, позволяющим ветке растения входить в эксикатор. Прыгающее кольцо также действует как прокладка между нижней и верхней частями сушильщика.
- Убедитесь, что прокладка достаточно стабильна, чтобы избежать сдавливания крышкой, достаточно гибкая, чтобы сгибаться и регулироваться по окружности эксикатора, и не изготовлена из пористого материала.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовался многожильный металлический провод, состоящий из нескольких скрученных вместе проволок меньшего размера, покрытых непористым пластиковым материалом, напоминающим прокладку (Рисунок 2). - Чтобы закрепить ветку на эксикаторе, используйте силиконовый оттискной материал. Убедитесь, что материал липкий, непористый, химически инертный к эксикатору и растению, а также легко наносится и заполняет небольшие зазоры между ветвью, прокладкой и эксикатором.
- Как только силиконовый оттискной материал полимеризуется (это занимает около 1 минуты) и закрепит ветку на месте, закройте эксикатор. Следите за тем, чтобы не оставалось зазоров.
- Подключите эксикатор к вакуумному насосу (Рисунок 3).
4. Вакуумная инфильтрация
- Запускайте вакуумный насос до тех пор, пока он не достигнет -0,07 МПа.
- Как только он достигнет этого давления, закройте напорный клапан и выключите вакуумный насос. Поддерживайте это давление в течение 5 минут.
- Откройте напорный клапан, чтобы восстановить давление в камере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень важный шаг. Постепенно и неуклонно восстанавливайте давление в камере. Для полного повышения давления в эксикаторе может потребоваться до 3 минут. Длительное повторное давление увеличивает количество бактерий, проникающих внутрь ткани10. - Повторите этот процесс еще два раза.
- Снимите ветку с клеточной суспензии и эксикатора.
- Пропитанные листья промыть дистиллированной водой.
5. Инкубация инфильтрированных листьев
- Оставьте инфильтрированные листья в темных условиях при температуре 25 °C в течение 48 часов.
- Затем подвергните инфильтрированную ткань 16/8-часовому световому/темному фотопериоду.
- Оцените транзиторную трансформацию листьев через 3-7 дней после заражения (DPI).
Рисунок 1: Какао покидает стадии развития. (А-Е) Стадии развития25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Конфигурация вакуумной камеры и ее компонентов. Вакуумная камера представляет собой эксикатор, соединенный с вакуумметром. Прокладка / уплотнительное кольцо обрезается таким образом, чтобы в нем было отверстие, куда будет помещена ветка. (A) Вакуумметр, (B) Крышка, (C) Прокладка / уплотнительное кольцо, (D) Напорный клапан, (E) Сушилка, (F) Шланг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: В системе вакуумной агроинфильтрации planta . Чтобы избежать потерь вакуума в процессе инфильтрации, очень важно закрепить ответвление на эксикаторе и прокладку/уплотнительное кольцо силиконовым оттискным материалом. (A) Растение какао, (B) Вакуумная камера, (C) Силиконовый оттискной материал, (D) Листья, погруженные в суспензию Agrobacterium , (E) Вакуумный насос. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Данный протокол представляет собой эффективный метод агроинфильтрации для крупноплодных древесных растений. С помощью этого протокола мы смогли достичь вакуумного давления -0,07 МПа, что привело к эффективной, локализованной инфильтрации листьев какао. На рисунке 4 показан процесс настройки инфильтрационной системы, а на рисунке 5 — окончательная конфигурация.
Иллюстрация 4: Настройка вакуумной камеры. (A) Обратите внимание на расположение ответвлений между двумя концами прокладки. Эта прокладка достаточно большая, чтобы ветка могла пройти между эксикатором и его крышкой. Обратите внимание, что из-за неровной поверхности ветки образуются зазоры. (B) Ответвление закрепляется на эксикаторе, а образовавшиеся зазоры заполняются силиконовым оттискным материалом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Настройка системы вакуумной инфильтрации. Пример настройки системы вакуумной инфильтрации для крупногабаритного какао-завода с использованием предложенного протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Во время первой стадии агроинфильтрации ткань подвергается пониженному давлению, что вызывает выход газов из устьичных полостей и прилегающих к ним воздушных пространств мезофилла через устьица и через раны. Мелкие пузырьки на поверхности листьев, погруженных в суспензию Agrobacterium , можно увидеть невооруженным глазом по мере увеличения вакуума. Следующим шагом является повышение давления в тканях и принудительное нагнетание суспензии Agrobacterium внутрь, чтобы заполнить пустоту, оставленную воздухом11. Инфильтрированные листья на некоторых участках имеют более темную окраску (рис. 6). Это указывает на то, что суспензия Agrobacterium проникла в ткань и распространилась повсюду, заполнив межклеточные пространства листа8.
Рисунок 6: Абаксиальный вид взрослых листьев какао после завершения вакуумной агроинфильтрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В рамках этого протокола была достигнута агроинфильтрация на локализованных листьях крупноплодных растений какао. Таким образом, мы временно трансформировали крупные растения какао с вектором, несущим 35S:RUBY , в качестве репортерной системы. Мы обнаружили, что эта репортерная система является полезным индикатором успешной переходной трансформации в какао, поскольку накопление беталаинов в листьях указывает на эффективность трансформации. Беталаины представляют собой ярко-красные пигменты, производящие безошибочный сигнал на зеленых листьях, который можно наблюдать невооруженным глазом (Рисунок 7). Поскольку листья прикреплены к растению, беталаины могут накапливаться, если инфильтрированная ткань сохраняет свою жизнеспособность. На рисунке 8 показан ряд результатов, варьирующих от высокого до низкого накопления беталаина на трансформированных листьях какао стадии С. Стоит отметить, что это первый случай переходной трансформации растений , зарегистрированный у этого вида.
Рисунок 7: Листья какао переходно трансформируются в сверхэкспрессию 35S: RUBY. Красные пятна на листьях какао, возникающие в результате накопления беталаина, являются простым и быстрым способом оценки предлагаемого протокола локализованной вакуумной агроинфильтрации у растений. Изображение с разрешением 6 точек на дюйм, масштабная линейка: 1 см, оптический зум: 8x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Накопление беталаина на листьях какао. Различные уровни и закономерности накопления беталаина на листьях какао при 6 DPI с помощью Agrobacterium-опосредованной транзиторной трансформации с помощью RUBY reporter. Масштабная линейка: 1 см, Оптический зум: 8x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| LB Средний | YM Средний | |
| Дрожжевой экстракт | 5 г/л | 0,4 г/л |
| Ферментативный дайджест триптона из казеина | 10 г/л | |
| NaCl | 5 г/л | 0,1 г/л |
| Маннитол | 10 г/л | |
| MgSO4·7ч20 | 0,204 г/л | |
| К2ХПО4 | 0,38 г/л | |
| МЧС | 1,95 г/л (10 мМ) | 1,95 г/л (10 мМ) |
| MgCl2 |
Таблица 1: Состав сред YM и LB.
Дополнительный рисунок 1: Репрезентативное изображение принудительной агроинфильтрации на листьях какао с помощью безыголочного шприца. Инфильтрация шприцем не приводила к экспрессии RUBBY в листьях, видимой невооруженным глазом, но приводила к повреждению в месте нажатия безыгольным шприцем. Изображение с разрешением 6 точек на дюйм, масштабная линейка: 5 мм, оптический зум: 25x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе мы представили эффективный, недорогой протокол агроинфильтрации для переходной трансформации древесных растений in planta на примере растений какао. Учитывая хорошо известное ограничение, которое кутикула листьев представляет для трансформации тканей растений, мы сосредоточились на разработке стратегии облегчения агроинфильтрации с помощью вакуума у древесных растений, которые обычно сопротивляются этой процедуре.
Достигнутое вакуумное давление внутри вакуумной камеры стало возможным только благодаря эффективной герметизации и заполнению небольших зазоров, образовавшихся между эксикатором, ветвью дерева, прокладкой/уплотнительным кольцом и крышкой эксикатора, что было основной проблемой протокола. По этой причине очень важно использовать силиконовый оттискной материал для фиксации ветки на эксикаторе. Этот материал непористый, достаточно липкий, чтобы приклеить ветвь к эксикатору и прокладке, и химически инертен, поэтому ни инфильтрированная ветка, ни эксикатор не повреждаются.
Кроме того, необходимо использовать вакуумный насос для достижения градиента давления внутри листовой секции, в результате чего воздух всасывается из устьичной полости и областей мезофилла, затем большой градиент давления при повышении давления проталкивает суспензию Agrobacterium в лист через устьица и ранит10. В качестве вакуумного насоса мы использовали сублимационную сушилку. Это пример универсальности и адаптируемости этого протокола к потребностям каждой лаборатории. Используя сублимационную сушилку в качестве вакуумного насоса, потребовалось около 3 минут, чтобы достичь -0,07 МПа. Это эффективно для какао, так как предыдущие авторы также инфильтрировали в вакуум отделившиеся листья какао с таким же вакуумным давлением25. Этот метод инфильтрации является предпочтительным, поскольку он более воспроизводим, чем неассистированная или безыгольная инфильтрация шприцем (дополнительный рисунок 1). При использовании вакуумного насоса для вакуумной инфильтрации пользователь может контролировать давление и время, в течение которого ткани подвергаются воздействию вакуума10.
У других растений, таких как тополь, было изучено, что структура листьев может влиять на эффективность инфильтрации из-за расположения клеток мезофилла. Различное и изменчивое расположение этих клеток может привести к неравномерной инфильтрации суспензией Agrobacterium 8,27, поскольку внутренняя структура листа имеет межклеточные воздушные промежутки8. Хотя самопроизвольная инфильтрация через устьица листьев может произойти при погружении листьев в суспензию Agrobacterium, атмосферное давление недостаточно эффективно, чтобы преодолеть эпидермальную кутикулу и вытеснить эти воздушные пространства с бактериальной суспензией; Это было опробовано с другими непокорными видами, такими как Persea americana18. По этой причине принудительная вакуум-опосредованная агроинфильтрация оказывается эффективным методом облегчения проникновения вещества в листья через устьица или раны10. Недавно сообщалось об инокуляции молодых саженцев какао инфекционным клоном вируса Ганы М с набухшим побегом какао путем биолитического инокуляции и агроинокуляции28. У какао большинство анализов переходной трансформации проводится на отделившихся листьях25,29, что приводит к снижению экспрессии из-за деградации растительного материала. Насколько нам известно, сообщений о транзиторной генетической трансформации in planta на растениях какао нет. Здесь мы добились первого переходного превращения какао, а ранее та же исследовательская группа достигла этого в Perseaamericana 18, что делает эту методологию жизнеспособной для возможного локализованного in vivo анализа метаболитов или молекул, которые экспрессируются только на листьях.
Переходное превращение с вектором 35S:RUBY было подтверждено переходной экспрессией беталаинов на листьях какао. Этот вектор восстанавливает биосинтетический путь беталаина на растениях, которые естественным образом не вырабатывают эти пигменты. Только некоторые Caryophyllales могут естественным образом биосинтезировать беталаины из тирозина с помощью своих собственных метаболических путей30. Чтобы воспроизвести этот метаболизм, 35S:RUBY содержит генетическую информацию для гетерологичной экспрессии трех ферментов, которые превращают обычно присутствующую аминокислоту тирозин в беталаины7.
Протоколы переходного преобразования в плантах имеют много преимуществ по сравнению со стабильными протоколами трансформации, включая более быструю, экономичную и повышенную эффективность преобразования31. Кроме того, транзиентная трансформация in planta может быть применена для многих функциональных геномных анализов32. Функциональные геномные исследования какао направлены на решение проблемы восприимчивости этого вида к болезням многих патогенов, таких как Moniliophthora perniciosa и Phytophthora spp33, повышение их засухоустойчивости34 и улучшение его органолептических качеств35. Этот протокол имеет потенциал для улучшения и углубления исследований функциональной геномики какао, поскольку он делает возможной переходную трансформацию in planta на деревьях какао большого размера или даже на других крупных непокорных и многолетних видах растений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не могут заявить о конфликте интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Lic. Хесусу Фуэнтесу Гонсалесу и Нестору Ивану Роблесу Оливаресу за помощь в съемках видеоматериала. Мы выражаем признательность доктору Антонии Гутьеррес Мора (Antonia Gutierrez Mora) из CIATEJ (растения какао Theobroma ). Мы также благодарим CIATEJ и Laboratorio Nacional PlanTECC, Мексика, за поддержку объекта. H.E.H.D. (CVU: 1135375) проводил магистерские исследования при финансовой поддержке Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México (CONAHCYT). R.U.L. выражает благодарность за поддержку со стороны Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL) и Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Халиско, Мексика (грант 7270-2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S:RUBY plasmid | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
| 1 mm electroporation cuvette | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus |
| Desiccator | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | For YM medium add 0.38 g/L |
| LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | For YM medium add 10 g/L |
| MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM) |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM) |
| MgSO4·7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | For YM medium add 0.204 g/L |
| MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| President Silicone Impression material | COLTENE | 60019938 | |
| Rifampicin | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg/mL) |
| Silicone Impression material gun | Andent | TBT06 | |
| Spectinomycin | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
| Streptomycin | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
| Tryptone enzymatic digest from casein | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | For LB medium add 10 g/L |
| Yeast extract | MCD LAB | 9031 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L |
References
- Huang, L. Q. Functional Genome of Medicinal Plants. Molecular Pharmacognosy. , Springer, Singapore. (2019).
- Janssen, B. J., Gardner, R. C. Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium. Plant Molecular Biology. 14 (1), 61-72 (1990).
- Wang, X., et al. Identification and functional analysis of in vivo phosphorylation sites of the Arabidopsis BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1 receptor kinase. Plant Cell. 17 (6), 1685-1703 (2005).
- Pan, Z., et al. In vivo assembly of the sorgoleone biosynthetic pathway and its impact on agroinfiltrated leaves of Nicotiana benthamiana. The New Phytologist. 230 (2), 683-697 (2021).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an agrobacterium-mediated method: Applications for gene expression and silencing studies. Nature Protocols. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Guo, M., Ye, J., Gao, D., Xu, N., Yang, J. Agrobacterium-mediated horizontal gene transfer: Mechanism, biotechnological application, potential risk and forestalling strategy. Biotechnology Advances. 37 (1), 259-270 (2019).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).
- Zheng, L., et al. An improved and efficient method of Agrobacterium syringe infiltration for transient transformation and its application in the elucidation of gene function in poplar. BMC Plant Biology. 21 (1), 54 (2021).
- Leuzinger, K., et al. Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 77, 50521 (2013).
- Chincinska, I. A. Leaf infiltration in plant science: old method, new possibilities. Plant Methods. 17 (1), 83 (2021).
- Simmons, C. W., Vandergheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102 (3), 965-970 (2009).
- Cao, D. V., et al. Optimization of Agrobacterium -mediated transient expression of heterologous genes in spinach. Plant Biotechnology Reports. 11, 397-405 (2017).
- Xie, L., et al. Virus-induced gene silencing in the perennial woody Paeonia ostii. PeerJ. 7, ee7001 (2019).
- Prasad Babu, K., Maligeppagol, M., Asokan, R., Krishna Reddy, M. Screening of a multi-virus resistant RNAi construct in cowpea through transient vacuum infiltration method. Virusdisease. 30 (2), 269-278 (2019).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. Two MARK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (6), 905-917 (2003).
- Deng, X., et al. Virus-induced gene silencing for Asteraceae-a reverse genetics approach for functional genomics in Gerbera hybrida. Plant Biotechnology Journal. 10 (8), 970-978 (2012).
- Wang, F., et al. Use of TRV-mediated VIGS for functional genomics research in citrus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 139 (3), 609-613 (2019).
- Salazar-González, J. A., et al. In-planta transient transformation of avocado (Persea americana) by vacuum agroinfiltration of aerial plant parts. Plant Cell Tissue Organ Cult. 152, 635-646 (2023).
- Bio-Rad. MicroPulserTM electroporation apparatus operating instructions and applications guide. The Bio-Rad Literature Library, Rev B Bulletin# M4006174 at. , www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4006174B.pdf (2010).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- GoldBio. Electrotransformation of Agrobacterium tumefaciens Protocol. , https://goldbio.com/documents/3906/Electrotransformation%20of%20agrobacterium%20tumefaciens.pdf (2018).
- Lindbo, J. A. TRBO: a high-efficiency tobacco mosaic virus RNA-based overexpression vector. Plant Physiology. 145 (4), 1232-1240 (2007).
- Rajasekaran, K. Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation of Cotton. Transgenic Crops of the World. Curtis, I. S. , Springer, Dordrecht. (2004).
- Llave, C., Kasschau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13401-13406 (2000).
- Fister, A. S., et al. Protocol: transient expression system for functional genomics in the tropical tree Theobroma cacao L. Plant Methods. 12, 19 (2016).
- Jung, S. -K., et al. Agrobacterium tumefaciens mediated transient expression of plant cell wall-degrading enzymes in detached sunflower leaves. Biotechnology Progress. 30 (1), 905-915 (2014).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (2), 259-273 (2005).
- Keith, C. V., Ramos-Sobrinho, R., Marelli, J. -P., Brown, J. K. Construction of an infectious clone of the Badnavirus Cacao Swollen Shoot Ghana M Virus and infectivity by gene gun- and Agrobacterium-mediated inoculation. Frontiers in Agronomy. 3, 774863 (2021).
- Fister, A. S., Landherr, L., Maximova, S. N., Guiltinan, M. J. Transient expression of CRISPR/Cas9 machinery targeting TcNPR3 enhances defense response in Theobroma cacao. Frontiers in Plant Science. 9, 268 (2018).
- Grützner, R., et al. Engineering betalain biosynthesis in tomato for high level betanin production in fruits. Frontiers in Plant Science. 12, 682443 (2021).
- Saifi, S. K., Passricha, N., Tuteja, R., Kharb, P., Tuteja, N. In planta transformation: A smart way of crop improvement. Advancement in Crop Improvement Techniques. 21, 351-362 (2020).
- Huda, K. M., et al. OsACA6, a P-type IIB Ca2+ ATPase promotes salinity and drought stress tolerance in tobacco by ROS scavenging and enhancing the expression of stress-responsive genes. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 76 (6), 997-1015 (2013).
- Micheli, F., et al.
- Bailey, B. A., et al. Fungal and plant gene expression during the colonization of cacao seedlings by endophytic isolates of four Trichoderma species. Planta. 224 (6), 1449-1464 (2006).
- Motamayor, J. C., et al. Geographic and genetic population differentiation of the Amazonian chocolate tree (Theobroma cacao L). PLoS ONE. 3 (10), e3311 (2008).
