Summary
Her presenterer vi den første protokollen for lokalisert vakuuminfiltrasjon for in vivo-studier av genetisk transformasjon av store planter. Ved hjelp av denne metodikken oppnådde vi for første gang Agrobacterium-mediert i planta forbigående transformasjon av kakao.
Abstract
Transient in planta transformation er et raskt og kostnadseffektivt alternativ for plantegenetisk transformasjon. De fleste protokoller for in planta-transformasjon er avhengige av bruk av Agrobacterium-mediert transformasjon. Protokollene som for tiden er i bruk, er imidlertid standardisert for små anlegg på grunn av de fysiske og økonomiske begrensningene ved å sende store planter til vakuumbehandling. Dette arbeidet presenterer en effektiv protokoll for lokalisert vakuumbasert agroinfiltrasjon tilpasset store planter. For å vurdere effekten av den foreslåtte metoden, testet vi bruken i kakaoplanter, en tropisk planteart som er gjenstridig mot genetisk transformasjon. Vår protokoll tillot påføring av opptil 0,07 MPa vakuum, med repetisjoner, til en lokalisert luftdel av kakaoblader, noe som gjør det mulig å tvinge infiltrasjonen av Agrobacterium inn i de intercellulære rommene i vedlagte blader. Som et resultat oppnådde vi Agrobacterium-mediert forbigående i planta-transformasjon av vedlagte kakaoblader som uttrykker seg for RUBY-reportersystemet. Dette er også den første Agrobacterium-mediert i planta forbigående transformasjon av kakao. Denne protokollen vil tillate anvendelse av den vakuumbaserte agroinfiltrasjonsmetoden til andre plantearter med lignende størrelsesbegrensninger og åpne døren for in planta-karakterisering av gener i gjenstridige treaktige, store arter.
Introduction
Plantegenetiske transformasjonsmetoder er avgjørende for å teste genenes biologiske funksjoner og er spesielt nyttige i dag gitt det store antallet ukarakteriserte gener som forutsies i postgenomisk tid1. Disse metodene kan brukes til å oppnå fullstendig transformerte linjer eller for å uttrykke gener forbigående. Stabil transformasjon oppstår når det fremmede DNA verten har tatt opp blir fullt og irreversibelt integrert i vertsgenomet, og de genetiske modifikasjonene overføres til etterfølgende generasjoner. Transient ekspresjon, kjent som forbigående transformasjon, oppstår fra flere kopier av T-DNA overført av Agrobacterium inn i cellen, som ikke er integrert i vertsgenomet, og topper 2-4 dager etter infeksjon2.
Det er verdt å merke seg at forbigående ekspresjonsanalyser ofte er tilstrekkelige for funksjonell karakterisering av gener og kan gi flere fordeler i forhold til stabil transformasjon. For eksempel krever forbigående transformasjon ikke vevskulturbaserte regenereringsprosedyrer. En annen fordel er at den er kompatibel med in planta funksjonell analyse av gener, eksisterende flere vellykkede eksempler på protokoller godt standardisert for modellplantearter, som Arabidopsis thaliana3 og Nicotiana benthamiana4, men fortsatt begrenset i ikke-modellarter5.
Utviklingen av forbigående analyser er avhengig av tilgjengeligheten av effektive genoverføringsmetoder. For dette er de mest populære tilnærmingene basert på Agrobacterium-infiltrasjon , som utnytter Agrobacteriums unike evne til å overføre DNA til planteceller6. Et annet nyttig verktøy for disse analysene er bruken av reportergener, for eksempel grønne fluorescerende proteiner (GFP), β-glukuronidase (GUS), luciferase eller RUBY, som alle brukes til å spore transformasjonshendelser. Blant disse reportersystemene er RUBY for tiden den enkleste å visualisere og er avhengig av omdannelsen av tyrosin til betalainer gjennom tre enzymatiske trinnreaksjoner. I motsetning til andre reportersystemer, kan de resulterende betalainene lett observeres som fargerike pigmenter på transformert plantevev uten behov for sofistikert utstyr eller ekstra reaktanter7.
Når du infiltrerer en Agrobacterium-suspensjon i det intercellulære rommet til bladmesofyllet, er det mest kritiske trinnet for vellykket agroinfeksjon å overvinne den fysiske barrieren pålagt av bladets epidermale kutikula8. Mens for noen planter er en trykkgradient opprettet med en nålfri sprøyte (sprøyte Agroinfiltrasjon) nok for en effektiv agroinfiltrasjon, som forekommer i Nicotiana benthamiana9, kan andre plantearter kreve en større trykkgradient som den som er opprettet ved hjelp av vakuumpumper10. I vakuumassisterte prosesser skjer agroinfiltrering i to trinn. I den første tjener vakuum til å utsette plantematerialet for redusert trykk, noe som tvinger utslipp av gasser fra mesofyllluftrommene gjennom stomata og sår. Deretter, under en trykkfase, infiltrerer Agrobacterium-suspensjonen de intercellulære rommene via spalteåpningen og sår11.
Sammenlignet med sprøyteinfiltrasjon gir vakuuminfiltrasjon høyere bruksfrekvens, repeterbarhet og evnen til å kontrollere trykk og varighet i alle stadier av infiltrasjonsprosessen10. I blader av forskjellige plantearter som spinat (Spinacia oleracea)12, peon (en treaktig flerårig) (Paeonia ostii)13 og cowpea (Vigna unguiculata)14, oppnådde vakuum agroinfiltrasjonsprotokoller en dypere infiltrasjonshastighet enn sprøyteinfiltrasjon. På samme måte, i tomat (Lycopersicon esculentum)15 og gerbera (Gerbera hybrida)16, ga vakuumagroinfiltrasjon sterkere og mer ensartet geninfiltrasjon enn sprøyteinfiltrasjon. En ekstra fordel med vakuuminfiltrasjon er den lavere avhengigheten av genotype, sammenlignet med sprøyteinfiltrasjon, som nylig ble observert i tre sitrusvarianter (Fortunella obovata, Citrus limon og C. grandis)17. Men når du prøver å bruke vakuum agroinfiltrasjon til planter som er for store til å passe inn i tørkemaskiner, kan størrelsen på vakuumkamrene være en begrensning, som vanligvis forekommer med tropiske treaktige planter.
Nedenfor beskriver vi en protokoll som overvinner den romlige begrensningen av vakuumkamre, og tester nytten for in planta forbigående transformasjon av kakaoblader. Vi presenterer den første lokaliserte vakuuminfiltrasjonsmetoden for kakao, som ikke krever ekstra utstyr og til og med tillater bruk av de samme laboratorietørkerne som brukes til infiltrasjon av hele anlegget, men med en enkel tilpasning som tillater tilgang til en del av anlegget inne i vakuumkammeret, slik at det kan brukes på forskjellige stadier av planteutvikling. For å teste nytten av den foreslåtte lokaliserte vakuuminfiltrasjonsmetoden, valgte vi kakao som proxy for en storbladet tropisk planteart som er vanskelig å transformere. Ved hjelp av denne lokaliserte infiltrasjonsmetoden rapporterte vi nylig den første i planta forbigående uttrykk i avokado ved Agrobacterium-mediert vakuuminfiltrasjon med forhold som tidligere var optimalisert for frittliggende blader18, og her rapporterer vi den første i planta forbigående uttrykk i kakao.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Agrobacterium tumefaciens kultur
- Tine elektrokompetente celler av Agrobacterium tumefaciens stamme LBA4404.
- Tilsett 1 ml gjærmalt (YM; Tabell 1) buljong til et 17 mm x 100 mm kulturrør. Lagre dette røret til senere, og hold det ved romtemperatur (RT).
- I et 1,5 ml mikrofugerør, tilsett 30 μL av de tinte Agrobacterium-cellene og 100-250 ng (opptil 5 μL) av DNA som inneholder 35S: RUBY. Bland forsiktig.
MERK: 35S: RUBY var en gave fra Yunde Zhao. For å unngå prøvebue, reduser tilstedeværelsen av ioniske forbindelser så mye som mulig. Disse ioniske forbindelsene kan være restsalter fra etanolutfelling av DNA19. - På dette tidspunktet legger du en 1 mm elektroporeringskyvette på is.
- Overfør den forrige suspensjonsblandingen til en avkjølt 1 mm elektroporeringskuvette. Hold alt på is. Tørk av de metalliske elektrodene på kuvetten.
- Sett elektroporatoren til Agr (2,2 kV, ~ 5 ms, 1 puls). Plasser kyvetten inne i elektroporeringskammeret.
- Trykk på Pulse-knappen . Registrer pulsparametrene. Hvis prøven buet, mislyktes elektroporeringsprosessen.
MERK: Det er viktig å raskt overføre cellene til YM-buljongen rett etter pulsen. Forsinkelse av denne overføringen kan dramatisk redusere transformasjonseffektiviteten20. - Bruk umiddelbart den lagrede YM-buljongen til å overføre cellene fra kyvetten til 17 mm x 100 mm røret. Bryt cellene forsiktig.
- Inkuber de transformerte cellene i 3 timer ved 28 ° C og 250 rpm på en orbital inkubator.
MERK: Denne kulturen har ikke antibiotika; Vær forsiktig med riktige aseptiske forhold. - Strek denne kulturen inn på selektive KFUM-agarplater21. For den transformerte LBA4404-RUBY-stammen, sørg for at disse platene inneholder rifampicin (25 μg / ml), spektinomycin (50 μg / ml) og streptomycin (50 μg / ml). Inkuber denne platen over natten i en 28 °C stående inkubator.
MERK: I denne protokollen ble vektoren 35S: RUBY brukt, som gir bakteriell resistens mot spectinomycin (50 μg / ml) og fungerer som en visuell reporter på infiltrert plantevev. - Inokulere kolonier fra overnattingskulturen på 12,5 ml av en blanding av YM-buljong og Luria Bertani (LB) buljong (i henholdsvis 9: 1-andel), 10 mM MES, pH 5,722. Forsikre deg om at dette selektive flytende mediet inneholder de samme antibiotika som ble brukt i trinn 1.10. Se tabell 1 for å se ingredienser og konsentrasjoner for disse mediene.
- Ved inkubering av Agrobacterium, la det være nok luftingsplass for kulturen, ca 4 til 5 ganger væskevolumet. Bruk YM-buljong til Agrobacterium-stamme LBA4404 for å unngå celleklumping23.
- Inkuber kulturen i 16 timer ved 250 o / min på en 28 ° C orbital inkubator.
- Skaler kulturen opptil 10 ganger startvolumet med samme medium som ble brukt i trinn 1.11.
- Inkuber kulturen i 16 timer og 250 o / min på en 28 ° C orbital inkubator.
- Juster nattens kultur til en optisk tetthet (OD600) på 0,4. Tilsett 20 μM acetosyringon (AS).
- Inkuber ved 250 o / min på en 28 ° C orbital inkubator til OD600 når ca. 1,0.
- Sentrifuger cellene ved 4 500 x g i 10 minutter ved 20 °C.
- Resuspender pelleten med suspensjonsløsning (10 mM MES, 10 mM MgCl2, pH 5,7), juster OD600 til 0,6. Legg til 200 μM AS24.
MERK: Pre-inkuber suspensjonsoppløsningen ved 28 °C. Hvis suspensjonsløsningen er kald når den tilsettes, vil cellene felles ut. - La bakterien stå i 2-24 timer i mørke omgivelser og 25 °C. Agitasjon er ikke nødvendig22.
2. Valg av plante
- Velg en plante med en gren med blader i det optimale stadiet for agroinfiltrering.
MERK: Planten kan være fullvoksen eller et modent tre. For kakao anbefales unge blader av C-stadium. Disse bladene er bronse til lysegrønne; de er ikke fullt utvidet eller så stive som trinn D blader25 (figur 1).- Som en kontroll, samtidig utføre agroinfiltration på andre planter (f.eks Nicotiana tabacum) med en høy agroinfiltration effektivitet som er rapportert for stammen og vektoren som brukes.
MERK: Hvis ingen positive resultater oppnås i denne kontrollen, er det mulig at de negative resultatene skyldes belastningen eller vektoren som brukes.
- Som en kontroll, samtidig utføre agroinfiltration på andre planter (f.eks Nicotiana tabacum) med en høy agroinfiltration effektivitet som er rapportert for stammen og vektoren som brukes.
3. Oppsett av vakuumkammer
- Som vakuumkammer, bruk en tørker som har en vakuummåler for å måle vakuumtrykket inni.
- Tilsett 250 μM jasmonsyre (JA)18,26 til Agrobacterium-suspensjonen fra trinn 1.19.
- Overfør Agrobacterium-kulturen til et bredt munnbeger for å senke den valgte grenen og bladene. Plasser deretter begeret med Agrobacterium-kulturen inne i tørketrommen.
- Plasser grenen mellom tørketrommelen og lokket. Sørg for å senke de ønskede bladene inne i Agrobacterium-kulturen . Deretter bruker du en hoppring, som er en rund ring med en utskjæring som gjør at plantegrenen kan komme inn i tørketrommen. Jump Ring fungerer også som et mellomrom mellom bunnen og toppen av Desiccator.
- Sørg for at pakningen er strukturelt stabil nok til å unngå å bli klemt med lokket, fleksibel nok til å bøye og justere til tørkerens omkrets, og ikke laget av et porøst materiale.
MERK: Denne studien brukte en strandet metalltråd bestående av flere mindre ledninger vridd sammen, belagt med et ikke-porøst plastmateriale som ligner en pakning (figur 2). - For å feste grenen på tørketrommelen, bruk silikonavtrykksmateriale. Sørg for at materialet er klebrig, ikke-porøst, kjemisk inert til tørkeren og anlegget, og lett å påføre og fylle små hull mellom grenen, pakningen og tørketrommelen.
- Når silikonavtrykksmaterialet polymeriseres (dette tar ca. 1 min) og fikser grenen på plass, lukker du tørkeren. Pass på at du ikke etterlater noen hull.
- Koble tørkebatteriet til vakuumpumpen (figur 3).
4. Vakuum infiltrasjon
- Start vakuumpumpen til den kommer til -0,07 MPa.
- Når den når dette trykket, lukker du trykkventilen og slår av vakuumpumpen. Oppretthold dette trykket i 5 minutter.
- Åpne trykkventilen for å gjenopprette kammertrykket.
MERK: Dette er et kritisk skritt. Gjenopprett kammertrykket gradvis og jevnt. Det kan ta opptil 3 minutter å trykke tørketrommelen helt opp. Utvidet trykksetting øker antall bakterier infiltrert inne i vevet10. - Gjenta denne prosessen to ganger til.
- Ta grenen av cellesuspensjonen og tørketrommelen.
- Rengjør de infiltrerte bladene med destillert vann.
5. Inkubasjon av infiltrerte blader
- La de infiltrerte bladene oppholde seg i mørke omgivelser ved 25 °C i 48 timer.
- Deretter utsetter du det infiltrerte vevet for en 16/8-timers lys / mørk fotoperiode.
- Evaluer den forbigående bladtransformasjonen 3-7 dager etter infeksjon (DPI).
Figur 1: Kakao forlater utviklingsstadier. (A-E) Utviklingsstadier25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vakuumkammerkonfigurasjon og dens komponenter. Vakuumkammeret er en tørkemaskin koblet til en vakuummåler. Pakningen/O-ringen er kuttet slik at den har en åpning der grenen skal plasseres. (A) Vakuummåler, (B) Lokk, (C) Pakning / O-ring, (D) Trykkventil, (E) Tørketromme, (F) Slange. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: I planta vakuum agroinfiltreringssystem. For å unngå vakuumtap under infiltrasjonsprosessen er det viktig å feste grenen til tørkeren og pakningen/O-ringen med silikonavtrykksmateriale. (A) Kakaoplante, (B) Vakuumkammer, (C) Silikonavtrykksmateriale, (D) Blader nedsenket på Agrobacterium-suspensjon , (E) Vakuumpumpe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen presenterer en effektiv agroinfiltreringsmetode for store treaktige planter. Med denne protokollen var vi i stand til å oppnå et vakuumtrykk på -0,07 MPa, noe som resulterte i effektiv, lokalisert infiltrasjon av kakaoblader. I figur 4 observerer vi infiltrasjonssystemets oppsettprosess, og i figur 5, den endelige konfigurasjonen.
Figur 4: Vakuumkammeroppsett. (A) Legg merke til grenplasseringen mellom de to endene av pakningen. Denne pakningen er stor nok til at grenen kan passere gjennom mellom tørkeren og lokket. Vær oppmerksom på at det er hull dannet på grunn av den uregelmessige overflaten av grenen. (B) Grenen er festet på tørkeren, og de dannede hullene er fylt med silikonavtrykksmaterialet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Oppsett av vakuuminfiltrasjonssystem. Eksempel på oppsett for vakuuminfiltrasjonssystemet for et stort kakaoanlegg ved bruk av den foreslåtte protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Under den første fasen av agroinfiltrering blir vevet utsatt for redusert trykk, noe som fører til at gasser frigjøres fra stomatale hulrom og tilstøtende mesofyllluftrom gjennom stomata og gjennom sårene. Små bobler på overflaten av bladene nedsenket i Agrobacterium-suspensjonen kan ses med det blotte øye når vakuumet øker. Det neste trinnet er å undertrykke vevet og tvinge Agrobacterium-suspensjonen inne for å fylle tomrummet som er igjen av luften11. Infiltrerte blader virker mørkere i fargen i enkelte områder (figur 6). Dette indikerer at Agrobacterium-suspensjonen har penetrert vevet og spredt seg overalt, og fylt de intercellulære rommene i bladet8.
Figur 6: Abaxial visning av voksne kakaoblader etter fullført vakuumagroinfiltrasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Denne protokollen oppnådde agroinfiltrasjon på lokaliserte blader av store kakaoplanter. Ved å gjøre det, transformerte vi forbigående store kakaoplanter med en vektor som bærer 35S: RUBY som et reportersystem. Vi fant dette reportersystemet en nyttig indikator på vellykket forbigående transformasjon i kakao fordi akkumuleringen av betalainer i bladene indikerer effektiviteten av transformasjonen. Betalains er lyse røde pigmenter, som produserer et umiskjennelig signal på de grønne bladene som kan observeres med det blotte øye (figur 7). Siden bladene er festet til planten, kan betalains akkumuleres dersom det infiltrerte vevet opprettholder sin levedyktighet. Figur 8 viser en rekke resultater, varierende fra høy til lav betalainakkumulering på transformerte kakaoblader i stadium C. Det er verdt å nevne at dette er den første i planta forbigående transformasjon rapportert på denne arten.
Figur 7: Kakaoblader forbigående transformert til overuttrykke 35S: RUBIN. Røde flekker på kakaoblader som følge av betalainakkumulering er en enkel og rask måte å evaluere den foreslåtte protokollen for lokalisert vakuumbasert agroinfiltrasjon i planta. Bilde ved 6 DPI, skala bar: 1 cm, optisk zoom: 8x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Betalainakkumulering på kakaoblader. Ulike nivåer og mønstre av betalainakkumulering på kakaoblader ved 6 DPI ved Agrobacterium-mediert forbigående transformasjon med RUBY-reporteren. Skala bar: 1 cm, Optisk zoom: 8x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| LB Medium | YM Medium | |
| Gjærekstrakt | 5 g/l | 0,4 g/l |
| Trypton enzymatisk fordøyelse fra kasein | 10 g/l | |
| NaCl | 5 g/l | 0,1 g/l |
| Mannitol | 10 g/l | |
| MgSO4 · 7t20 | 0,204 g/l | |
| K2HPO4 | 0,38 g/l | |
| MES | 1,95 g/l (10 mM) | 1,95 g/l (10 mM) |
| MgCl2 |
Tabell 1: Sammensetning av YM- og LB-medier.
Tilleggsfigur 1: Representativt bilde av forsert agroinfiltrasjon på kakaoblader ved bruk av en nålfri sprøyte. Sprøyteinfiltrasjon resulterte ikke i RUBY-uttrykk i bladene som var synlige for det blotte øye, men resulterte i skade på det punktet hvor trykk ble påført med den nålefrie sprøyten. Bilde med 6 DPI, skala bar: 5 mm, optisk zoom: 25x. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbeidet presenterte vi en effektiv, billig agroinfiltrasjonsprotokoll for in planta forbigående transformasjon av treaktige planter, ved hjelp av kakaoplanter som et eksempel. Gitt den velkjente begrensningen som bladets kutikula representerer for transformasjon av plantevev, konsentrerte vi oss om å utvikle en strategi for å lette agroinfiltrering ved vakuum i treaktige planter, som vanligvis er gjenstridige mot denne prosedyren.
Det oppnådde vakuumtrykket inne i vakuumkammeret var bare mulig på grunn av effektiv forsegling og fylling av de små hullene som ble opprettet mellom tørkeren, tregrenen, pakningen/O-ringen og tørkerens lokk, som var hovedutfordringen med protokollen. Av denne grunn er det viktig å bruke silikonavtrykksmateriale for å feste grenen på tørkeren. Dette materialet er ikke-porøst, viser seg å være klebrig nok til å feste grenen til tørkeren og pakningen, og er kjemisk inert, slik at verken den infiltrerte grenen eller tørkeren er skadet.
I tillegg er det nødvendig å bruke en vakuumpumpe for å oppnå en trykkgradient inne i bladseksjonen, noe som fører til at luft suges ut av stomatalhulen og mesofyllområdene, og en stor trykkgradient under trykksetting skyver Agrobacterium-suspensjonen inn i bladet gjennom stomata og sår10. Vi brukte en frysetørker som vakuumpumpe. Dette er et eksempel på allsidigheten og tilpasningsevnen til denne protokollen til hvert laboratoriums behov. Ved å bruke frysetørkeren som vakuumpumpe tok det omtrent 3 minutter å nå -0,07 MPa. Dette er effektivt for kakao siden tidligere forfattere også har vakuuminfiltrert kakaofrittliggende blader med samme vakuumtrykk25. Dette er den foretrukne infiltrasjonsmetoden siden den er mer repeterbar enn ikke-assistert eller nålefri sprøyteinfiltrasjon (tilleggsfigur 1). Når du bruker en vakuumpumpe for vakuuminfiltrasjon, kan brukeren kontrollere trykket og tiden vevet utsettes for vakuum10.
I andre planter, som poppel, har det blitt studert at bladstrukturen kan påvirke infiltrasjonseffektiviteten på grunn av arrangementet av mesofyllcellene. De forskjellige og variable arrangementene av disse cellene kan resultere i en ujevn infiltrasjon av Agrobacterium-suspensjonen 8,27 da bladets indre struktur har intercellulære luftgap8. Selv om spontan infiltrasjon gjennom bladets stomata kan skje når bladene senkes i en Agrobacterium-suspensjon, er atmosfærisk trykk ikke effektivt nok til å overvinne epidermal kutikula og forskyve disse luftrommene med bakteriell suspensjon; Dette har blitt forsøkt med andre gjenstridige arter som Persea americana18. Av denne grunn viser tvungen vakuummediert agroinfiltrasjon å være en effektiv metode for å lette stoffinntrengning i bladene gjennom spalteåpningen eller sårene10. Inokulering av unge kakaoplanter med badnaviruset kakaohovent skudd Ghana M-virussmittsom klon ved biolistisk inokulering og agroinokulering er nylig rapportert28. I kakao utføres de fleste forbigående transformasjonsanalyser på frittliggende blader25,29, noe som resulterer i redusert forbigående ekspresjonsvedlikehold på grunn av nedbrytningen av plantematerialet. Så vidt vi vet, er det ingen rapporter om i planta forbigående genetisk transformasjon på kakaoplanter. Her oppnådde vi den første transiente transformasjonen av kakao, og tidligere oppnådde vår samme studiegruppe dette i Persea americana18, noe som gjør dette til en levedyktig metodikk for mulig lokalisert in vivo analyse av metabolitter eller molekyler som bare uttrykkes på blader.
Transient transformasjon med 35S:RUBY-vektoren ble bekreftet av det forbigående uttrykket av betalains på kakaobladene. Denne vektoren rekonstituerer betalain biosyntetiske vei på planter som ikke naturlig produserer disse pigmentene. Bare noen Caryophyllales kan naturlig biosyntetisere betalains fra tyrosin med sine egne metabolske veier30. For å replikere denne metabolismen inneholder 35S: RUBY den genetiske informasjonen for det heterologe uttrykket av tre enzymer som omdanner den vanlig tilstedeværende aminosyren tyrosin til betalains7.
I planta har transiente transformasjonsprotokoller mange fordeler i forhold til stabile transformasjonsprotokoller, inkludert raskere, kostnadseffektiv og forbedret transformasjonseffektivitet31. Videre kan i planta forbigående transformasjon anvendes for mange funksjonelle genomikkanalyser32. Funksjonelle genomstudier på kakao tar sikte på å løse sykdomsfølsomheten til denne arten for mange patogener, som Moniliophthora perniciosa og Phytophthora spp33, øker tørkebestandigheten34 og forbedrer dens organoleptiske egenskaper35. Denne protokollen har potensial til å forbedre og utdype kakaofunksjonelle genomstudier siden den gjør det mulig å omgå transformasjoner i planta på store kakaotrær eller til og med i andre store gjenstridige og flerårige plantearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingen interessekonflikt å oppgi.
Acknowledgments
Vi takker Lic. Jesús Fuentes González og Néstor Iván Robles Olivares for deres hjelp med å filme videoopptakene. Vi anerkjenner de sjenerøse gaver av Dr. Antonia Gutierrez Mora av CIATEJ (Theobroma kakao planter). Vi takker også CIATEJ og Laboratorio Nacional PlanTECC, México, for støtte fra anlegget. H.E.H.D. (CVU: 1135375) gjennomførte masterstudier med finansiering fra Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México (CONAHCYT). R.U.L. anerkjenner støtte fra Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL), og Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Jalisco, México (Grant 7270-2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S:RUBY plasmid | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
| 1 mm electroporation cuvette | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus |
| Desiccator | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | For YM medium add 0.38 g/L |
| LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | For YM medium add 10 g/L |
| MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM) |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM) |
| MgSO4·7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | For YM medium add 0.204 g/L |
| MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| President Silicone Impression material | COLTENE | 60019938 | |
| Rifampicin | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg/mL) |
| Silicone Impression material gun | Andent | TBT06 | |
| Spectinomycin | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
| Streptomycin | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
| Tryptone enzymatic digest from casein | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | For LB medium add 10 g/L |
| Yeast extract | MCD LAB | 9031 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L |
References
- Huang, L. Q. Functional Genome of Medicinal Plants. Molecular Pharmacognosy. , Springer, Singapore. (2019).
- Janssen, B. J., Gardner, R. C. Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium. Plant Molecular Biology. 14 (1), 61-72 (1990).
- Wang, X., et al. Identification and functional analysis of in vivo phosphorylation sites of the Arabidopsis BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1 receptor kinase. Plant Cell. 17 (6), 1685-1703 (2005).
- Pan, Z., et al. In vivo assembly of the sorgoleone biosynthetic pathway and its impact on agroinfiltrated leaves of Nicotiana benthamiana. The New Phytologist. 230 (2), 683-697 (2021).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an agrobacterium-mediated method: Applications for gene expression and silencing studies. Nature Protocols. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Guo, M., Ye, J., Gao, D., Xu, N., Yang, J. Agrobacterium-mediated horizontal gene transfer: Mechanism, biotechnological application, potential risk and forestalling strategy. Biotechnology Advances. 37 (1), 259-270 (2019).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).
- Zheng, L., et al. An improved and efficient method of Agrobacterium syringe infiltration for transient transformation and its application in the elucidation of gene function in poplar. BMC Plant Biology. 21 (1), 54 (2021).
- Leuzinger, K., et al. Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 77, 50521 (2013).
- Chincinska, I. A. Leaf infiltration in plant science: old method, new possibilities. Plant Methods. 17 (1), 83 (2021).
- Simmons, C. W., Vandergheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102 (3), 965-970 (2009).
- Cao, D. V., et al. Optimization of Agrobacterium -mediated transient expression of heterologous genes in spinach. Plant Biotechnology Reports. 11, 397-405 (2017).
- Xie, L., et al. Virus-induced gene silencing in the perennial woody Paeonia ostii. PeerJ. 7, ee7001 (2019).
- Prasad Babu, K., Maligeppagol, M., Asokan, R., Krishna Reddy, M. Screening of a multi-virus resistant RNAi construct in cowpea through transient vacuum infiltration method. Virusdisease. 30 (2), 269-278 (2019).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. Two MARK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (6), 905-917 (2003).
- Deng, X., et al. Virus-induced gene silencing for Asteraceae-a reverse genetics approach for functional genomics in Gerbera hybrida. Plant Biotechnology Journal. 10 (8), 970-978 (2012).
- Wang, F., et al. Use of TRV-mediated VIGS for functional genomics research in citrus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 139 (3), 609-613 (2019).
- Salazar-González, J. A., et al. In-planta transient transformation of avocado (Persea americana) by vacuum agroinfiltration of aerial plant parts. Plant Cell Tissue Organ Cult. 152, 635-646 (2023).
- Bio-Rad. MicroPulserTM electroporation apparatus operating instructions and applications guide. The Bio-Rad Literature Library, Rev B Bulletin# M4006174 at. , www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4006174B.pdf (2010).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- GoldBio. Electrotransformation of Agrobacterium tumefaciens Protocol. , https://goldbio.com/documents/3906/Electrotransformation%20of%20agrobacterium%20tumefaciens.pdf (2018).
- Lindbo, J. A. TRBO: a high-efficiency tobacco mosaic virus RNA-based overexpression vector. Plant Physiology. 145 (4), 1232-1240 (2007).
- Rajasekaran, K. Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation of Cotton. Transgenic Crops of the World. Curtis, I. S. , Springer, Dordrecht. (2004).
- Llave, C., Kasschau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13401-13406 (2000).
- Fister, A. S., et al. Protocol: transient expression system for functional genomics in the tropical tree Theobroma cacao L. Plant Methods. 12, 19 (2016).
- Jung, S. -K., et al. Agrobacterium tumefaciens mediated transient expression of plant cell wall-degrading enzymes in detached sunflower leaves. Biotechnology Progress. 30 (1), 905-915 (2014).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (2), 259-273 (2005).
- Keith, C. V., Ramos-Sobrinho, R., Marelli, J. -P., Brown, J. K. Construction of an infectious clone of the Badnavirus Cacao Swollen Shoot Ghana M Virus and infectivity by gene gun- and Agrobacterium-mediated inoculation. Frontiers in Agronomy. 3, 774863 (2021).
- Fister, A. S., Landherr, L., Maximova, S. N., Guiltinan, M. J. Transient expression of CRISPR/Cas9 machinery targeting TcNPR3 enhances defense response in Theobroma cacao. Frontiers in Plant Science. 9, 268 (2018).
- Grützner, R., et al. Engineering betalain biosynthesis in tomato for high level betanin production in fruits. Frontiers in Plant Science. 12, 682443 (2021).
- Saifi, S. K., Passricha, N., Tuteja, R., Kharb, P., Tuteja, N. In planta transformation: A smart way of crop improvement. Advancement in Crop Improvement Techniques. 21, 351-362 (2020).
- Huda, K. M., et al. OsACA6, a P-type IIB Ca2+ ATPase promotes salinity and drought stress tolerance in tobacco by ROS scavenging and enhancing the expression of stress-responsive genes. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 76 (6), 997-1015 (2013).
- Micheli, F., et al.
- Bailey, B. A., et al. Fungal and plant gene expression during the colonization of cacao seedlings by endophytic isolates of four Trichoderma species. Planta. 224 (6), 1449-1464 (2006).
- Motamayor, J. C., et al. Geographic and genetic population differentiation of the Amazonian chocolate tree (Theobroma cacao L). PLoS ONE. 3 (10), e3311 (2008).
