Summary
Hier presenteren we het eerste protocol voor gelokaliseerde vacuüminfiltratie voor in vivo studies van de genetische transformatie van grote planten. Met behulp van deze methodologie bereikten we voor het eerst de Agrobacterium-gemedieerde in planta voorbijgaande transformatie van cacao.
Abstract
Transient in planta transformatie is een snel en kosteneffectief alternatief voor plant genetische transformatie. De meeste protocollen voor in planta-transformatie zijn gebaseerd op het gebruik van Agrobacterium-gemedieerde transformatie. De protocollen die momenteel in gebruik zijn, zijn echter gestandaardiseerd voor kleine installaties vanwege de fysieke en economische beperkingen van het onderwerpen van grote installaties aan een vacuümbehandeling. Dit werk presenteert een effectief protocol voor gelokaliseerde, op vacuüm gebaseerde agro-infiltratie, aangepast voor grote planten. Om de werkzaamheid van de voorgestelde methode te beoordelen, hebben we het gebruik ervan getest in cacaoplanten, een tropische plantensoort die recalcitrant is voor genetische transformatie. Ons protocol maakte het mogelijk om tot 0,07 MPa vacuüm toe te passen, met herhalingen, op een gelokaliseerd bovengronds deel van cacaobladeren, waardoor het mogelijk werd om de infiltratie van Agrobacterium in de intercellulaire ruimtes van aangehechte bladeren te forceren. Als gevolg hiervan bereikten we de Agrobacterium-gemedieerde transiënt in planta-transformatie van gehechte cacaobladeren die tot expressie komen voor het RUBY-reportersysteem. Dit is ook de eerste Agrobacterium-gemedieerde in planta voorbijgaande transformatie van cacao. Dit protocol zou de toepassing van de op vacuüm gebaseerde agro-infiltratiemethode mogelijk maken op andere plantensoorten met vergelijkbare groottebeperkingen en de deur openen voor de karakterisering van genen in recalcitrante houtachtige, grote soorten.
Introduction
Plantgenetische transformatiemethoden zijn essentieel voor het testen van de biologische functies van genen en zijn vandaag de dag vooral nuttig gezien het grote aantal niet-gekarakteriseerde genen dat wordt voorspeld in het post-genomische tijdperk1. Deze methoden kunnen worden gebruikt om volledig getransformeerde lijnen te verkrijgen of om genen tijdelijk tot expressie te brengen. Stabiele transformatie vindt plaats wanneer het vreemde DNA dat de gastheer heeft opgenomen volledig en onomkeerbaar wordt geïntegreerd in het genoom van de gastheer en de genetische modificaties worden doorgegeven aan volgende generaties. Voorbijgaande expressie, bekend als voorbijgaande transformatie, vindt plaats door de meerdere kopieën van T-DNA die door Agrobacterium in de cel zijn overgebracht, die niet zijn geïntegreerd in het genoom van de gastheer, en piekt 2-4 dagen na infectie2.
Het is vermeldenswaard dat transiënte expressietesten vaak voldoende zijn voor de functionele karakterisering van genen en verschillende voordelen kunnen bieden ten opzichte van stabiele transformatie. Voor tijdelijke transformatie zijn bijvoorbeeld geen regeneratieprocedures op basis van weefselkweek nodig. Een ander voordeel is dat het compatibel is met in planta functionele analyse van genen, bestaande verschillende succesvolle voorbeelden van protocollen die goed gestandaardiseerd zijn voor modelplantensoorten, zoals Arabidopsis thaliana3 en Nicotiana benthamiana4, maar nog steeds beperkt in niet-modelsoorten5.
De ontwikkeling van transiënte assays is afhankelijk van de beschikbaarheid van efficiënte methoden voor genoverdracht. Hiervoor zijn de meest populaire benaderingen gebaseerd op Agrobacterium-infiltratie , die profiteert van het unieke vermogen van Agrobacterium om DNA over te brengen naar plantencellen6. Een ander nuttig hulpmiddel voor deze analyses is het gebruik van reportergenen, zoals groen fluorescerende eiwitten (GFP), β-glucuronidase (GUS), luciferase of RUBY, die allemaal worden gebruikt om transformatiegebeurtenissen te volgen. Van deze reportersystemen is RUBY momenteel het gemakkelijkst te visualiseren en vertrouwt het op de omzetting van tyrosine in betalains door middel van drie enzymatische stapreacties. In tegenstelling tot andere reportersystemen kunnen de resulterende betalains gemakkelijk worden waargenomen als felgekleurde pigmenten op getransformeerd plantenweefsel zonder dat er geavanceerde apparatuur of extra reactanten nodig zijn7.
Bij het infiltreren van een Agrobacterium-suspensie in de intercellulaire ruimte van het mesofyl van het blad, is de meest kritische stap voor een succesvolle agro-infectie het overwinnen van de fysieke barrière die wordt opgelegd door de epidermale cuticula van de bladeren. Terwijl voor sommige planten een drukgradiënt gecreëerd met een naaldloze spuit (spuit Agroinfiltratie) voldoende is voor een efficiënte agro-infiltratie, zoals gebeurt in Nicotiana benthamiana9, kunnen andere plantensoorten een grotere drukgradiënt nodig hebben, zoals die gecreëerd met behulp van vacuümpompen10. In vacuümondersteunde processen vindt agro-infiltratie plaats in twee stappen. In de eerste dient vacuüm om het plantmateriaal aan verminderde druk te onderwerpen, waardoor gassen uit de mesofylle luchtruimten via huidmondjes en wonden vrijkomen. Vervolgens, tijdens een herdrukfase, infiltreert de Agrobacterium-suspensie de intercellulaire ruimtes via de huidmondjes en wonden11.
Vergeleken met injectiespuitinfiltratie zorgt vacuüminfiltratie voor een hogere gebruiksfrequentie, herhaalbaarheid en de mogelijkheid om de druk en duur in elke fase van het infiltratieproces te regelen10. In bladeren van verschillende plantensoorten zoals spinazie (Spinacia oleracea)12, pioenroos (een houtachtige vaste plant) (Paeonia ostii)13 en cowpea (Vigna unguiculata)14 bereikten vacuümagro-infiltratieprotocollen een diepere infiltratiesnelheid dan injectiespuitinfiltratie. Ook in tomaat (Lycopersicon esculentum)15 en gerbera (Gerbera hybrida)16 produceerde vacuüm agro-infiltratie een sterkere en meer uniforme gen-uitschakeling dan injectiespuitinfiltratie. Een bijkomend voordeel van vacuüminfiltratie is de lagere afhankelijkheid van het genotype, in vergelijking met injectiespuitinfiltratie, die onlangs werd waargenomen bij drie citrusvariëteiten (Fortunella obovata, Citrus limon en C. grandis)17. Wanneer u echter probeert vacuümagro-infiltratie toe te passen op planten die te groot zijn om in exsiccatoren te passen, kan de grootte van de vacuümkamers een beperking zijn, zoals meestal gebeurt bij tropische houtachtige planten.
Hieronder beschrijven we een protocol dat de ruimtelijke beperking van vacuümkamers overwint en het nut ervan test voor in planta voorbijgaande transformatie van cacaobladeren. We presenteren de eerste gelokaliseerde vacuüminfiltratiemethode voor cacao, waarvoor geen extra apparatuur nodig is en die zelfs het gebruik van dezelfde laboratoriumexsiccatoren mogelijk maakt die worden gebruikt voor de infiltratie van de hele plant, maar met een eenvoudige aanpassing die de toegang tot een deel van de plant in de vacuümkamer mogelijk maakt, waardoor het gebruik ervan in verschillende stadia van de ontwikkeling van de plant mogelijk is. Om het nut van de voorgestelde gelokaliseerde vacuüminfiltratiemethode te testen, selecteerden we cacao als proxy van een grootbladige tropische plantensoort die moeilijk te transformeren is. Met behulp van deze gelokaliseerde infiltratiemethode rapporteerden we onlangs de eerste in planta voorbijgaande expressie in avocado door Agrobacterium-gemedieerde vacuüminfiltratie met omstandigheden die eerder waren geoptimaliseerd voor losse bladeren18, en hier rapporteren we de eerste in planta voorbijgaande expressie in cacao.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Agrobacterium tumefaciens-cultuur
- Ontdooi elektrocompetente cellen van Agrobacterium tumefaciens stam LBA4404.
- Voeg 1 ml gistmout (YM; Tabel 1) bouillon in een kweekbuis van 17 mm x 100 mm. Bewaar deze tube voor later, en bewaar hem op kamertemperatuur (RT).
- Voeg in een microfugebuisje van 1,5 ml 30 μl van de ontdooide Agrobacterium-cellen en 100-250 ng (tot 5 μL) DNA met 35S:RUBY toe. Meng voorzichtig.
LET OP: De 35S:RUBY was een geschenk van Yunde Zhao. Om vonkvorming van het monster te voorkomen, moet u de aanwezigheid van ionische verbindingen zoveel mogelijk verminderen. Deze ionische verbindingen kunnen restzouten zijn van de ethanolneerslag van DNA19. - Plaats nu een elektroporatiecuvet van 1 mm op ijs.
- Breng het vorige suspensiemengsel over in een gekoelde elektroporatiecuvet van 1 mm. Houd alles in ijs. Veeg de metalen elektroden van de cuvet schoon.
- Stel de elektroporator in op Agr (2.2 kV, ~5 ms, 1 puls). Plaats de cuvet in de elektroporatiekamer.
- Druk op de pulse-knop. Registreer de pulsparameters. Als het monster een boog maakte, mislukte het elektroporatieproces.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de cellen direct na de puls snel over te brengen naar de YM-bouillon. Het uitstellen van deze overdracht kan de transformatie-efficiëntie drastisch verminderen20. - Gebruik onmiddellijk de opgeslagen YM-bouillon om de cellen van de cuvet over te brengen naar de buis van 17 mm x 100 mm. Resuspendeer de cellen voorzichtig.
- Incubeer de getransformeerde cellen gedurende 3 uur bij 28 °C en 250 rpm op een orbitale incubator.
OPMERKING: Deze cultuur bevat geen antibiotica; Wees voorzichtig met de juiste aseptische omstandigheden. - Streep deze cultuur op selectieve YM-agarplaten21. Zorg er voor de getransformeerde LBA4404-RUBY-stam voor dat deze platen rifampicine (25 μg/ml), spectinomycine (50 μg/ml) en streptomycine (50 μg/ml) bevatten. Incubeer deze plaat een nacht in een staande broedmachine van 28 °C.
OPMERKING: In dit protocol werd de vector 35S:RUBY gebruikt, die bacteriële resistentie tegen spectinomycine (50 μg/ml) verleent en functioneert als een visuele verslaggever van geïnfiltreerd plantenweefsel. - Inoculeer kolonies uit de nachtcultuur op 12,5 ml van een mengsel van YM-bouillon en Luria Bertani (LB)-bouillon (respectievelijk in een verhouding van 9:1), 10 mM MES, pH 5,722. Zorg ervoor dat dit selectieve vloeibare medium dezelfde antibiotica bevat die in stap 1.10 zijn gebruikt. Raadpleeg Tabel 1 om de ingrediënten en concentraties voor deze media te zien.
- Laat bij het incuberen van Agrobacterium voldoende beluchtingsruimte over voor de cultuur, ongeveer 4 tot 5 keer het vloeistofvolume. Gebruik YM-bouillon voor Agrobacterium-stam LBA4404 om celklontering te voorkomen23.
- Incubeer de cultuur gedurende 16 uur bij 250 omw/min op een orbitale incubator van 28 °C.
- Schaal de cultuur op tot 10 keer het oorspronkelijke volume met hetzelfde medium dat in stap 1.11 is gebruikt.
- Incubeer de cultuur gedurende 16 uur en 250 omw/min op een orbitale incubator van 28 °C.
- Stel de nachtcultuur in op een optische dichtheid (OD600) van 0,4. Voeg 20 μM acetosyringon (AS) toe.
- Incubeer bij 250 omwentelingen per minuut op een orbitale incubator van 28 °C tot de OD600 ongeveer 1,0 bereikt.
- Centrifugeer de cellen bij 4 500 x g gedurende 10 minuten bij 20 °C.
- Resuspendeer de pellet met suspensieoplossing (10 mM MES, 10 mM MgCl2, pH 5,7) en stel de OD600 in op 0,6. Voeg 200 μM AS24 toe.
OPMERKING: Pre-incubeer de suspensieoplossing bij 28 °C. Als de suspensieoplossing koud is wanneer deze wordt toegevoegd, zullen de cellen neerslaan. - Laat de bacteriële suspensie 2-24 uur staan in donkere omstandigheden en 25 °C. Agitatie is niet vereist22.
2. Selectie van planten
- Kies een plant met een tak met bladeren in het optimale stadium voor agro-infiltratie.
OPMERKING: De plant kan volgroeid zijn of een volwassen boom. Voor cacao worden jonge bladeren van het C-stadium aanbevolen. Deze bladeren zijn brons- tot lichtgroen van kleur; ze zijn niet volledig uitgezet en ook niet zo stijf als stadium D-bladeren25 (Figuur 1).- Voer ter controle tegelijkertijd agro-infiltratie uit op andere planten (bijv. Nicotiana tabacum) met een hoge agro-infiltratie-efficiëntie die wordt gerapporteerd voor de gebruikte stam en vector.
OPMERKING: Als bij deze controle geen positieve resultaten worden verkregen, is het mogelijk dat de negatieve resultaten te wijten zijn aan de gebruikte stam of vector.
- Voer ter controle tegelijkertijd agro-infiltratie uit op andere planten (bijv. Nicotiana tabacum) met een hoge agro-infiltratie-efficiëntie die wordt gerapporteerd voor de gebruikte stam en vector.
3. Vacuümkamer instellen
- Gebruik als vacuümkamer een exsiccator met een vacuümmeter om de vacuümdruk binnenin te meten.
- Voeg 250 μM jasmonzuur (JA)18,26 toe aan de Agrobacterium-suspensie uit stap 1.19.
- Breng de Agrobacterium-cultuur over in een bekerglas met wijde opening om de geselecteerde tak en bladeren onder te dompelen. Plaats vervolgens het bekerglas met Agrobacterium-cultuur in de exsiccator .
- Plaats de tak tussen de exsiccator en het deksel. Zorg ervoor dat u de gewenste bladeren onderdompelt in de Agrobacterium-cultuur . Gebruik vervolgens een buigring, een ronde ring met een uitsparing waardoor de plantentak de exsiccator kan binnendringen. De Jump Ring fungeert ook als een afstandhouder tussen de onder- en bovenkant van de Desiccator.
- Zorg ervoor dat de pakking structureel stabiel genoeg is om te voorkomen dat hij met het deksel wordt geplet, flexibel genoeg om te buigen en aan te passen aan de omtrek van de exsiccator en niet van poreus materiaal is gemaakt.
OPMERKING: In deze studie werd gebruik gemaakt van een gevlochten metaaldraad bestaande uit verschillende kleinere draden die in elkaar zijn gedraaid, bedekt met een niet-poreus plastic materiaal dat lijkt op een pakking (Figuur 2). - Gebruik siliconenafdrukmateriaal om de tak op de exsiccator te bevestigen. Zorg ervoor dat het materiaal plakkerig, niet-poreus, chemisch inert is voor de exsiccator en de plant, en gemakkelijk aan te brengen en kleine openingen tussen de tak, de pakking en de exsiccator op te vullen.
- Zodra het siliconenafdrukmateriaal polymeriseert (dit duurt ongeveer 1 minuut) en de tak op zijn plaats houdt, sluit u de exsiccator af. Zorg ervoor dat u geen gaten achterlaat.
- Sluit de exsiccator aan op de vacuümpomp (Figuur 3).
4. Vacuüm infiltratie
- Start de vacuümpomp totdat deze -0.07 MPa bereikt.
- Zodra deze druk is bereikt, sluit u het drukventiel en schakelt u de vacuümpomp uit. Houd deze druk 5 minuten aan.
- Open het drukventiel om de kamerdruk te herstellen.
OPMERKING: Dit is een cruciale stap. Herstel de kamerdruk geleidelijk en gestaag. Het kan tot 3 minuten duren om de exsiccator volledig onder druk te zetten. Langdurige herdrukking verhoogt het aantal bacteriën dat in het weefsel is geïnfiltreerd10. - Herhaal dit proces nog twee keer.
- Haal de tak van de celsuspensie en de exsiccator af.
- Reinig de geïnfiltreerde bladeren met gedestilleerd water.
5. Incubatie van geïnfiltreerde bladeren
- Laat de geïnfiltreerde bladeren 48 uur in donkere omstandigheden bij 25 °C staan.
- Stel het geïnfiltreerde weefsel vervolgens bloot aan een 16/8-uur licht/donker fotoperiode.
- Evalueer de voorbijgaande bladtransformatie 3-7 dagen na infectie (DPI).
Figuur 1: Cacao verlaat ontwikkelingsstadia. (A-E) Ontwikkelingsstadia25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 2: Configuratie van de vacuümkamer en zijn componenten. De vacuümkamer is een exsiccator die is aangesloten op een vacuümmeter. De pakking/O-ring is zo gesneden dat er een opening is waar de aftakking komt te zitten. (A) Vacuümmeter, (B) Deksel, (C) Pakking/O-ring, (D) Drukventiel, (E) Exsiccator (F) Slang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: In planta vacuüm agro-infiltratie systeem. Om vacuümverliezen tijdens het infiltratieproces te voorkomen, is het van cruciaal belang om de aftakking aan de exsiccator en de pakking/O-ring vast te zetten met siliconenafdrukmateriaal. (A) Cacaoplant, (B) Vacuümkamer, (C) Siliconenafdrukmateriaal, (D) Bladeren ondergedompeld in Agrobacterium-suspensie , (E) Vacuümpomp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol presenteert een effectieve agro-infiltratiemethode voor grote houtige planten. Met dit protocol waren we in staat om een vacuümdruk van -0,07 MPa te bereiken, wat resulteerde in de effectieve, gelokaliseerde infiltratie van cacaobladeren. In figuur 4 zien we het proces voor het opzetten van het infiltratiesysteem en in figuur 5 de uiteindelijke configuratie.
Afbeelding 4: Vacuümkamer instellen. (A) Let op de plaatsing van de aftakking tussen de twee uiteinden van de pakking. Deze pakking is groot genoeg om de tak tussen de exsiccator en het deksel door te laten. Merk op dat er openingen zijn gevormd door het onregelmatige oppervlak van de tak. (B) De tak wordt bevestigd op de exsiccator en de gevormde openingen worden gevuld met het materiaal van de siliconeafdruk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Opstelling vacuüminfiltratiesysteem. Voorbeeld van de opstelling voor het vacuüminfiltratiesysteem voor een grote cacaoplant met behulp van het voorgestelde protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tijdens de eerste fase van agro-infiltratie wordt het weefsel onderworpen aan verminderde druk, waardoor gassen vrijkomen uit de huidmondholten en aangrenzende mesofylle luchtruimten via de huidmondjes en door de wonden. Kleine belletjes op het oppervlak van de bladeren ondergedompeld in de Agrobacterium-suspensie zijn met het blote oog te zien naarmate het vacuüm toeneemt. De volgende stap is om de weefsels opnieuw onder druk te zetten en de Agrobacterium-suspensie naar binnen te dwingen om de leegte te vullen die door de lucht is achtergelaten11. Geïnfiltreerde bladeren lijken op sommige plaatsen donkerder van kleur (Figuur 6). Dit geeft aan dat de Agrobacterium-suspensie het weefsel is binnengedrongen en zich overal heeft verspreid, waardoor de intercellulaire ruimtes van het bladworden gevuld 8.
Figuur 6: Abaxiaal beeld van volwassen cacaobladeren na voltooiing van vacuüm agro-infiltratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Dit protocol zorgde voor agro-infiltratie op gelokaliseerde bladeren van grote cacaoplanten. Door dit te doen, hebben we tijdelijk grote cacaoplanten getransformeerd met een vector met 35S:RUBY als reportersysteem. We vonden dit reportersysteem een nuttige indicator voor een succesvolle transiënte transformatie in cacao, omdat de ophoping van betalains in de bladeren de efficiëntie van de transformatie aangeeft. Betalains zijn felrode pigmenten, die een onmiskenbaar signaal op de groene bladeren produceren dat met het blote oog kan worden waargenomen (Figuur 7). Omdat de bladeren aan de plant vastzitten, kunnen betalaïnen zich ophopen als het geïnfiltreerde weefsel zijn levensvatbaarheid behoudt. Figuur 8 toont een reeks resultaten, variërend van een hoge tot een lage accumulatie van betalaïne op getransformeerde cacaobladeren van stadium C. Het is vermeldenswaard dat dit de eerste is in planta voorbijgaande transformatie gerapporteerd over deze soort.
Figuur 7: Cacaobladeren tijdelijk getransformeerd tot overexpressie 35S: RUBY. Rode vlekken op cacaobladeren als gevolg van accumulatie van betalaïne zijn een eenvoudige en snelle manier om het voorgestelde protocol van gelokaliseerde vacuümgebaseerde agro-infiltratie in planta te evalueren. Afbeelding op 6 DPI, schaalbalk: 1 cm, optische zoom: 8x. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8: Ophoping van betalaïne op cacaobladeren. Verschillende niveaus en patronen van betalaï-accumulatie op cacaobladeren bij 6 DPI door Agrobacterium-gemedieerde voorbijgaande transformatie met de RUBY-reporter. Schaalbalk: 1 cm, Optische zoom: 8x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| LB Gemiddeld | YM Normaal | |
| Gist extract | 5 g/l | 0,4 g/l |
| Trypton enzymatische digest uit caseïne | 10 g/l | |
| NaCl | 5 g/l | 0,1 g/l |
| Mannitol | 10 g/l | |
| MgSO4·7h20 | 0,204 g/l | |
| K2HPO4 | 0,38 g/l | |
| KNOEIEN | 1,95 g/l (10 mM) | 1,95 g/l (10 mM) |
| MgCl2 |
Tabel 1: Samenstelling van YM- en LB-media.
Aanvullende figuur 1: Representatief beeld van geforceerde agro-infiltratie op cacaobladeren met behulp van een naaldloze spuit. Infiltratie van de spuit resulteerde niet in ROBIJN-expressie in de bladeren die met het blote oog zichtbaar waren, maar resulteerde wel in schade op het punt waar druk werd uitgeoefend met de naaldloze spuit. Beeld bij 6 DPI, schaalbalk: 5 mm, optische zoom: 25x. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit werk presenteerden we een efficiënt, goedkoop agro-infiltratieprotocol voor de in planta voorbijgaande transformatie van houtige planten, met cacaoplanten als voorbeeld. Gezien de bekende beperking die de cuticula van bladeren vertegenwoordigt voor de transformatie van plantenweefsels, concentreerden we ons op het ontwikkelen van een strategie om agro-infiltratie door vacuüm te vergemakkelijken in houtachtige planten, die meestal recalcitrant zijn voor deze procedure.
De bereikte vacuümdruk in de vacuümkamer was alleen mogelijk dankzij de efficiënte afdichting en opvulling van de kleine openingen die waren ontstaan tussen de exsiccator en de boomtak, de pakking/O-ring en het deksel van de exsiccator en de grootste uitdaging van het protocol. Om deze reden is het van cruciaal belang om siliconenafdrukmateriaal te gebruiken om de tak op de exsiccator te bevestigen. Dit materiaal is niet-poreus, blijkt kleverig genoeg te zijn om de tak aan de exsiccator en de pakking te hechten, en is chemisch inert, zodat noch de geïnfiltreerde tak, noch de exsiccator wordt beschadigd.
Bovendien is het noodzakelijk om een vacuümpomp te gebruiken om een drukgradiënt in het bladgedeelte te bereiken, waardoor lucht uit de huidmondholte en mesofylgebieden wordt gezogen, waarna een grote drukgradiënt tijdens het opnieuw onder druk brengen de Agrobacterium-suspensie in het blad duwt via huidmondjes en wonden10. We gebruikten een vriesdroger als vacuümpomp. Dit is een voorbeeld van de veelzijdigheid en het aanpassingsvermogen van dit protocol aan de behoeften van elk laboratorium. Met behulp van de vriesdroger als vacuümpomp duurde het ongeveer 3 minuten om -0.07 MPa te bereiken. Dit is effectief voor cacao, aangezien eerdere auteurs ook vacuüm geïnfiltreerde cacaobladeren hebben losgemaakt met dezelfde vacuümdruk25. Dit is de voorkeursinfiltratiemethode, omdat deze beter herhaalbaar is dan infiltratie zonder hulp of naaldloze injectiespuit (aanvullende figuur 1). Bij gebruik van een vacuümpomp voor vacuüminfiltratie kan de gebruiker de druk en de tijd regelen dat de weefsels worden blootgesteld aan het vacuüm10.
Bij andere planten, zoals populier, is onderzocht dat de bladstructuur de infiltratie-efficiëntie kan beïnvloeden vanwege de rangschikking van de mesofylcellen. De verschillende en variabele rangschikking van deze cellen kan leiden tot een ongelijkmatige infiltratie door de Agrobacterium-suspensie 8,27, aangezien de inwendige structuur van het blad intercellulaire luchtspleten heeft8. Hoewel spontane infiltratie door de huidmondjes van de bladeren kan optreden bij het onderdompelen van de bladeren in een Agrobacterium-suspensie, is de atmosferische druk niet effectief genoeg om de epidermale cuticula te overwinnen en deze luchtruimten te verdringen met de bacteriële suspensie; dit is geprobeerd met andere recalcitrante soorten zoals Persea americana18. Om deze reden blijkt geforceerde vacuümgemedieerde agro-infiltratie een efficiënte methode te zijn om het binnendringen van stoffen in de bladeren via de huidmondjes of wonden te vergemakkelijken10. Inoculatie van jonge cacaozaailingen met het badnavirus cacao gezwollen scheut Ghana M-virus infectieuze kloon door biolistische inoculatie en agro-inoculatie is onlangs gemeld28. In cacao worden de meeste transiënte transformatietests uitgevoerd op losse bladeren25,29, wat resulteert in een verminderd onderhoud van de transiënte expressie als gevolg van de afbraak van het plantaardig materiaal. Voor zover wij weten, zijn er geen meldingen van in planta voorbijgaande genetische transformatie op cacaoplanten. Hier bereikten we de eerste voorbijgaande transformatie van cacao, en eerder bereikte dezelfde studiegroep dit in Persea americana18, waardoor dit een levensvatbare methodologie is voor mogelijke gelokaliseerde in vivo analyse van metabolieten of moleculen die alleen op bladeren tot expressie komen.
Voorbijgaande transformatie met de 35S:RUBY-vector werd bevestigd door de voorbijgaande expressie van betalains op de cacaobladeren. Deze vector reconstrueert de biosynthetische route van betalaïne op planten die deze pigmenten niet van nature produceren. Slechts enkele Caryophyllales kunnen op natuurlijke wijze betalaïnen biosynthetiseren uit tyrosine met hun eigen metabole routes30. Om dit metabolisme na te bootsen, bevat 35S:RUBY de genetische informatie voor de heterologe expressie van drie enzymen die het algemeen aanwezige aminozuur tyrosine omzetten in betalains7.
In planta hebben transiënte transformatieprotocollen veel voordelen ten opzichte van stabiele transformatieprotocollen, waaronder snellere, kosteneffectieve en verbeterde transformatie-efficiëntie31. Bovendien kan in planta transiënte transformatie worden toegepast voor veel functionele genomics-analyse32. Functionele genomics-studies op cacao hebben tot doel de ziektegevoeligheid van deze soort voor vele ziekteverwekkers, zoals Moniliophthora perniciosa en Phytophthora spp33, op te lossen, hun droogteresistentie te verhogen34 en de organoleptische eigenschappen ervan te verbeteren35. Dit protocol heeft het potentieel om de functionele genomics-studies van cacao te verbeteren en te verdiepen, omdat het in planta voorbijgaande transformatie mogelijk maakt op grote cacaobomen of zelfs in andere grote recalcitrante en meerjarige plantensoorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hoeven geen belangenconflict te melden.
Acknowledgments
Wij danken Lic. Jesús Fuentes González en Néstor Iván Robles Olivares voor hun hulp bij het filmen van de videobeelden. We zijn dankbaar voor de gulle giften van Dr. Antonia Gutierrez Mora van CIATEJ (Theobroma cacaoplanten ). We danken ook CIATEJ en Laboratorio Nacional PlanTECC, México, voor de facilitaire ondersteuning. H.E.H.D. (CVU: 1135375) voerde masterstudies uit met financiering van de Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México (CONAHCYT). R.U.L. erkent steun van Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL) en Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Jalisco, México (Grant 7270-2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S:RUBY plasmid | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
| 1 mm electroporation cuvette | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus |
| Desiccator | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | For YM medium add 0.38 g/L |
| LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | For YM medium add 10 g/L |
| MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM) |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM) |
| MgSO4·7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | For YM medium add 0.204 g/L |
| MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| President Silicone Impression material | COLTENE | 60019938 | |
| Rifampicin | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg/mL) |
| Silicone Impression material gun | Andent | TBT06 | |
| Spectinomycin | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
| Streptomycin | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
| Tryptone enzymatic digest from casein | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | For LB medium add 10 g/L |
| Yeast extract | MCD LAB | 9031 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L |
References
- Huang, L. Q. Functional Genome of Medicinal Plants. Molecular Pharmacognosy. , Springer, Singapore. (2019).
- Janssen, B. J., Gardner, R. C. Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium. Plant Molecular Biology. 14 (1), 61-72 (1990).
- Wang, X., et al. Identification and functional analysis of in vivo phosphorylation sites of the Arabidopsis BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1 receptor kinase. Plant Cell. 17 (6), 1685-1703 (2005).
- Pan, Z., et al. In vivo assembly of the sorgoleone biosynthetic pathway and its impact on agroinfiltrated leaves of Nicotiana benthamiana. The New Phytologist. 230 (2), 683-697 (2021).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an agrobacterium-mediated method: Applications for gene expression and silencing studies. Nature Protocols. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Guo, M., Ye, J., Gao, D., Xu, N., Yang, J. Agrobacterium-mediated horizontal gene transfer: Mechanism, biotechnological application, potential risk and forestalling strategy. Biotechnology Advances. 37 (1), 259-270 (2019).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).
- Zheng, L., et al. An improved and efficient method of Agrobacterium syringe infiltration for transient transformation and its application in the elucidation of gene function in poplar. BMC Plant Biology. 21 (1), 54 (2021).
- Leuzinger, K., et al. Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 77, 50521 (2013).
- Chincinska, I. A. Leaf infiltration in plant science: old method, new possibilities. Plant Methods. 17 (1), 83 (2021).
- Simmons, C. W., Vandergheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102 (3), 965-970 (2009).
- Cao, D. V., et al. Optimization of Agrobacterium -mediated transient expression of heterologous genes in spinach. Plant Biotechnology Reports. 11, 397-405 (2017).
- Xie, L., et al. Virus-induced gene silencing in the perennial woody Paeonia ostii. PeerJ. 7, ee7001 (2019).
- Prasad Babu, K., Maligeppagol, M., Asokan, R., Krishna Reddy, M. Screening of a multi-virus resistant RNAi construct in cowpea through transient vacuum infiltration method. Virusdisease. 30 (2), 269-278 (2019).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. Two MARK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (6), 905-917 (2003).
- Deng, X., et al. Virus-induced gene silencing for Asteraceae-a reverse genetics approach for functional genomics in Gerbera hybrida. Plant Biotechnology Journal. 10 (8), 970-978 (2012).
- Wang, F., et al. Use of TRV-mediated VIGS for functional genomics research in citrus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 139 (3), 609-613 (2019).
- Salazar-González, J. A., et al. In-planta transient transformation of avocado (Persea americana) by vacuum agroinfiltration of aerial plant parts. Plant Cell Tissue Organ Cult. 152, 635-646 (2023).
- Bio-Rad. MicroPulserTM electroporation apparatus operating instructions and applications guide. The Bio-Rad Literature Library, Rev B Bulletin# M4006174 at. , www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4006174B.pdf (2010).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- GoldBio. Electrotransformation of Agrobacterium tumefaciens Protocol. , https://goldbio.com/documents/3906/Electrotransformation%20of%20agrobacterium%20tumefaciens.pdf (2018).
- Lindbo, J. A. TRBO: a high-efficiency tobacco mosaic virus RNA-based overexpression vector. Plant Physiology. 145 (4), 1232-1240 (2007).
- Rajasekaran, K. Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation of Cotton. Transgenic Crops of the World. Curtis, I. S. , Springer, Dordrecht. (2004).
- Llave, C., Kasschau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13401-13406 (2000).
- Fister, A. S., et al. Protocol: transient expression system for functional genomics in the tropical tree Theobroma cacao L. Plant Methods. 12, 19 (2016).
- Jung, S. -K., et al. Agrobacterium tumefaciens mediated transient expression of plant cell wall-degrading enzymes in detached sunflower leaves. Biotechnology Progress. 30 (1), 905-915 (2014).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (2), 259-273 (2005).
- Keith, C. V., Ramos-Sobrinho, R., Marelli, J. -P., Brown, J. K. Construction of an infectious clone of the Badnavirus Cacao Swollen Shoot Ghana M Virus and infectivity by gene gun- and Agrobacterium-mediated inoculation. Frontiers in Agronomy. 3, 774863 (2021).
- Fister, A. S., Landherr, L., Maximova, S. N., Guiltinan, M. J. Transient expression of CRISPR/Cas9 machinery targeting TcNPR3 enhances defense response in Theobroma cacao. Frontiers in Plant Science. 9, 268 (2018).
- Grützner, R., et al. Engineering betalain biosynthesis in tomato for high level betanin production in fruits. Frontiers in Plant Science. 12, 682443 (2021).
- Saifi, S. K., Passricha, N., Tuteja, R., Kharb, P., Tuteja, N. In planta transformation: A smart way of crop improvement. Advancement in Crop Improvement Techniques. 21, 351-362 (2020).
- Huda, K. M., et al. OsACA6, a P-type IIB Ca2+ ATPase promotes salinity and drought stress tolerance in tobacco by ROS scavenging and enhancing the expression of stress-responsive genes. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 76 (6), 997-1015 (2013).
- Micheli, F., et al.
- Bailey, B. A., et al. Fungal and plant gene expression during the colonization of cacao seedlings by endophytic isolates of four Trichoderma species. Planta. 224 (6), 1449-1464 (2006).
- Motamayor, J. C., et al. Geographic and genetic population differentiation of the Amazonian chocolate tree (Theobroma cacao L). PLoS ONE. 3 (10), e3311 (2008).
