Summary
Her præsenterer vi den første protokol for lokaliseret vakuuminfiltration til in vivo-undersøgelser af den genetiske transformation af store planter. Ved hjælp af denne metode opnåede vi for første gang Agrobacterium-medieret i planta forbigående transformation af kakao.
Abstract
Transient i planta transformation er et hurtigt og omkostningseffektivt alternativ til plantegenetisk transformation. De fleste protokoller for in planta transformation er afhængige af brugen af Agrobacterium-medieret transformation. De protokoller, der i øjeblikket er i brug, er imidlertid standardiseret for små anlæg på grund af de fysiske og økonomiske begrænsninger ved at underkaste store anlæg en vakuumbehandling. Dette arbejde præsenterer en effektiv protokol for lokaliseret vakuumbaseret agroinfiltration tilpasset store planter. For at vurdere effektiviteten af den foreslåede metode testede vi dens anvendelse i kakaoplanter, en tropisk planteart, der er genstridig over for genetisk transformation. Vores protokol tillod påføring af op til 0,07 MPa vakuum med gentagelser på en lokaliseret luftdel af kakaoblade, hvilket gjorde det muligt at tvinge infiltrationen af Agrobacterium ind i de intercellulære rum af vedhæftede blade. Som et resultat opnåede vi den Agrobacterium-medierede transient i planta transformation af vedhæftede kakaoblade, der udtrykker sig for RUBY-reportersystemet. Dette er også den første Agrobacterium-medieret i planta forbigående transformation af kakao. Denne protokol vil gøre det muligt at anvende den vakuumbaserede agroinfiltrationsmetode på andre plantearter med lignende størrelsesbegrænsninger og åbne døren for in planta karakterisering af gener i genstridige træagtige arter af stor størrelse.
Introduction
Plantegenetiske transformationsmetoder er afgørende for at teste genernes biologiske funktioner og er især nyttige i dag i betragtning af det store antal ukarakteriserede gener, der blev forudsagt i den postgenomiske æra1. Disse metoder kan bruges til at opnå fuldt transformerede linjer eller til at udtrykke gener forbigående. Stabil transformation opstår, når det fremmede DNA, værten har optaget, bliver fuldt og irreversibelt integreret i værtsgenomet, og de genetiske modifikationer overføres til efterfølgende generationer. Transient ekspression, kendt som forbigående transformation, forekommer fra de mange kopier af T-DNA, der overføres af Agrobacterium til cellen, som ikke er integreret i værtsgenomet, og topper 2-4 dage efter infektion2.
Det er værd at bemærke, at forbigående ekspressionsassays ofte er tilstrækkelige til funktionel karakterisering af gener og kan tilbyde flere fordele i forhold til stabil transformation. For eksempel kræver forbigående transformation ikke vævskulturbaserede regenereringsprocedurer. En anden fordel er, at det er kompatibelt med in planta funktionel analyse af gener, der findes flere vellykkede eksempler på protokoller, der er godt standardiseret for modelplantearter, såsom Arabidopsis thaliana3 og Nicotiana benthamiana4, men stadig begrænset i ikke-modelarter5.
Udviklingen af forbigående assays afhænger af tilgængeligheden af effektive genoverførselsmetoder. Til dette er de mest populære tilgange baseret på Agrobacterium-infiltration , som udnytter Agrobacteriums unikke evne til at overføre DNA til planteceller6. Et andet nyttigt værktøj til disse analyser er brugen af reportergener, såsom grønne fluorescerende proteiner (GFP), β-glucuronidase (GUS), luciferase eller RUBY, som alle anvendes til at spore transformationsbegivenheder. Blandt disse reportersystemer er RUBY i øjeblikket den nemmeste at visualisere og er afhængig af omdannelsen af tyrosin til betalainer gennem tre enzymatiske trinreaktioner. I modsætning til andre reportersystemer kan de resulterende betalainer let observeres som farvestrålende pigmenter på transformeret plantevæv uden behov for sofistikeret udstyr eller yderligere reaktanter7.
Når man infiltrerer en Agrobacterium-suspension i det intercellulære rum i bladmesofylen, er det mest kritiske trin for vellykket agroinfektion at overvinde den fysiske barriere, der pålægges af bladets epidermale neglebånd8. Mens for nogle planter er en trykgradient skabt med en nålefri sprøjte (sprøjte Agroinfiltration) tilstrækkelig til en effektiv agroinfiltration, som det forekommer i Nicotiana benthamiana9, kan andre plantearter kræve en større trykgradient som den, der er skabt ved hjælp af vakuumpumper10. I vakuumassisterede processer forekommer agroinfiltration i to trin. I den første tjener vakuum til at udsætte plantematerialet for reduceret tryk, hvilket tvinger frigivelsen af gasser fra mesofylluftrummet gennem stomata og sår. Derefter infiltrerer Agrobacterium-suspensionen under en repressuriseringsfase de intercellulære rum via stomata og sår11.
Sammenlignet med sprøjteinfiltration giver vakuuminfiltration mulighed for højere brugsfrekvens, repeterbarhed og evnen til at kontrollere tryk og varighed på hvert trin i infiltrationsprocessen10. I blade af forskellige plantearter såsom spinat (Spinacia oleracea)12, pæon (en træagtig flerårig) (Paeonia ostii)13 og Cowpea (Vigna unguiculata)14 opnåede vakuumagroinfiltrationsprotokoller en dybere infiltrationshastighed end sprøjteinfiltration. På samme måde frembragte vakuumagroinfiltration i tomat (Lycopersicon esculentum)15 og gerbera (Gerbera hybrida)16 stærkere og mere ensartet genhæmning end sprøjteinfiltration. En yderligere fordel ved vakuuminfiltration er den lavere afhængighed af genotype sammenlignet med sprøjteinfiltration, som for nylig blev observeret i tre citrussorter (Fortunella obovata, Citrus limon og C. grandis)17. Men når man forsøger at anvende vakuumagroinfiltration på planter, der er for store til at passe ind i ekssikkatorer, kan størrelsen af vakuumkamrene være en begrænsning, som det typisk sker med tropiske træagtige planter.
Nedenfor beskriver vi en protokol, der overvinder vakuumkamrenes rumlige begrænsning og tester dens anvendelighed til i planta forbigående transformation af kakaoblade. Vi præsenterer den første lokaliserede vakuuminfiltrationsmetode til kakao, som ikke kræver ekstra udstyr og endda tillader brugen af de samme laboratorieekssikkatorer, der anvendes til infiltration af hele planten, men med en simpel tilpasning, der giver adgang til en del af planten inde i vakuumkammeret, hvilket tillader dets anvendelse på forskellige stadier af planteudvikling. For at teste nytten af den foreslåede lokale vakuuminfiltrationsmetode valgte vi kakao som en proxy for en storbladet tropisk planteart, der er vanskelig at transformere. Ved hjælp af denne lokaliserede infiltrationsmetode rapporterede vi for nylig den første i planta forbigående ekspression i avocado ved Agrobacterium-medieret vakuuminfiltration med betingelser, der tidligere var optimeret til løsrevne blade18, og her rapporterer vi den første i planta forbigående ekspression i kakao.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Agrobacterium tumefaciens kultur
- Optø elektrokompetente celler af Agrobacterium tumefaciens stamme LBA4404.
- Tilsæt 1 ml gærmalt (YM; Tabel 1) bouillon til et 17 mm x 100 mm kulturrør. Gem tuben til senere, og opbevar den ved stuetemperatur (RT).
- I et 1,5 ml mikrofugerør tilsættes 30 μL af de optøede Agrobacterium-celler og 100-250 ng (op til 5 μL) af DNA'et indeholdende 35S:RUBY. Bland forsigtigt.
BEMÆRK: 35S: RUBY var en gave fra Yunde Zhao. For at undgå prøvebuedannelse skal du reducere tilstedeværelsen af ioniske forbindelser så meget som muligt. Disse ionforbindelser kan være restsalte fra ethanoludfældningen af DNA19. - På dette tidspunkt anbringes en 1 mm elektroporationskuvette på is.
- Den tidligere suspensionsblanding overføres til en kølet 1 mm elektroporationskuvette. Hold alt på is. Tør kuvettens metalliske elektroder af.
- Indstil elektroporatoren til Agr (2,2 kV, ~5 ms, 1 puls). Placer kuvetten inde i elektroporationskammeret.
- Tryk på knappen Puls . Registrer pulsparametrene. Hvis prøven buede, mislykkedes elektroporationsprocessen.
BEMÆRK: Det er vigtigt hurtigt at overføre cellerne til YM bouillon lige efter pulsen. Forsinkelse af denne overførsel kan dramatisk reducere transformationseffektiviteten20. - Brug straks den gemte YM bouillon til at overføre cellerne fra kuvetten til 17 mm x 100 mm røret. Resuspender cellerne forsigtigt.
- De transformerede celler inkuberes i 3 timer ved 28 °C og 250 o/min på en orbital inkubator.
BEMÆRK: Denne kultur har ikke antibiotika; Vær forsigtig med korrekte aseptiske forhold. - Stribe denne kultur på selektive YM agarplader21. For den transformerede LBA4404-RUBY-stamme skal du sikre dig, at disse plader indeholder rifampicin (25 μg / ml), spectinomycin (50 μg / ml) og streptomycin (50 μg / ml). Denne plade inkuberes natten over i en 28 °C stående inkubator.
BEMÆRK: I denne protokol blev vektoren 35S:RUBY anvendt, som giver bakteriel resistens over for spectinomycin (50 μg/ml) og fungerer som visuel reporter på infiltreret plantevæv. - Pod kolonier fra natkulturen på 12,5 ml af en blanding af YM bouillon og Luria Bertani (LB) bouillon (i forholdet 9: 1), 10 mM MES, pH 5,722. Sørg for, at dette selektive flydende medium indeholder de samme antibiotika, som blev anvendt i trin 1.10. Se tabel 1 for at se ingredienserne og koncentrationerne for disse medier.
- Ved inkubation af Agrobacterium skal du efterlade nok luftningsplads til kulturen, ca. 4 til 5 gange væskevolumenet. Brug YM bouillon til Agrobacterium stamme LBA4404 for at undgå celleklumpning23.
- Kulturen inkuberes i 16 timer ved 250 o/min på en orbitalinkubator på 28 °C.
- Skaler kulturen op til 10 gange det oprindelige volumen med det samme medium, der blev brugt i trin 1.11.
- Kulturen inkuberes i 16 timer og 250 o/min på en orbitalinkubator på 28 °C.
- Natkulturen justeres til en optisk densitet (OD600) på 0,4. Der tilsættes 20 μM acetosyringon (AS).
- Der inkuberes ved 250 rpm på en 28 °C orbital inkubator, indtil OD600 når ca. 1,0.
- Cellerne centrifugeres ved 4 500 x g i 10 minutter ved 20 °C.
- Resuspender pellet med suspensionsopløsning (10 mM MES, 10 mMMgCl2, pH 5,7), juster OD600 til 0,6. Tilføj 200 μM AS24.
BEMÆRK: Suspensionsopløsningen forinkuberes ved 28 °C. Hvis suspensionsopløsningen er kold, når den tilsættes, udfældes cellerne. - Bakteriesuspensionen henstår i 2-24 timer under mørke forhold og 25 °C. Agitation er ikke påkrævet22.
2. Valg af plante
- Vælg en plante med en gren med blade i det optimale stadium til agroinfiltration.
BEMÆRK: Planten kan være fuldvoksen eller et modent træ. Til kakao anbefales unge blade af C-stadiet. Disse blade er bronze til lysegrøn farvet; de er ikke fuldt udvidede eller så stive som trin D blade25 (figur 1).- Som kontrol skal du samtidig udføre agroinfiltration på andre planter (f.eks. Nicotiana tabacum) med en høj agroinfiltrationseffektivitet, der rapporteres for den anvendte stamme og vektor.
BEMÆRK: Hvis der ikke opnås positive resultater i denne kontrol, er det muligt, at de negative resultater skyldes den anvendte stamme eller vektor.
- Som kontrol skal du samtidig udføre agroinfiltration på andre planter (f.eks. Nicotiana tabacum) med en høj agroinfiltrationseffektivitet, der rapporteres for den anvendte stamme og vektor.
3. Opsætning af vakuumkammer
- Som vakuumkammer skal du bruge en ekssikkator, der har en vakuummåler til at måle vakuumtrykket indeni.
- Der tilsættes 250 μM Jasmonsyre (JA)18,26 til Agrobacterium-suspensionen fra trin 1.19.
- Overfør Agrobacterium-kulturen til et bægerglas med bred mund for at nedsænke den valgte gren og blade. Placer derefter bægerglasset med Agrobacterium-kulturen inde i ekssikkatoren.
- Placer grenen mellem ekssikkatoren og dens låg. Sørg for at nedsænke de ønskede blade inde i Agrobacterium-kulturen . Brug derefter en springring, som er en rund ring med en udskæring, der gør det muligt for plantegrenen at komme ind i ekssikkatoren. Springringen fungerer også som afstandsstykke mellem bunden og toppen af tørreren.
- Sørg for, at pakningen er strukturelt stabil nok til at undgå at blive klemt med låget, fleksibel nok til at bøje og justere til ekssikkatorens omkreds og ikke lavet af et porøst materiale.
BEMÆRK: Denne undersøgelse brugte en strenget metaltråd bestående af flere mindre ledninger snoet sammen, belagt med et ikke-porøst plastmateriale, der lignede en pakning (figur 2). - For at fastgøre grenen på ekssikkatoren skal du bruge silikoneaftryksmateriale. Sørg for, at materialet er klæbrigt, ikke-porøst, kemisk inaktivt for ekssikkatoren og planten og let at påføre og udfylde små huller mellem grenen, pakningen og ekssikkatoren.
- Når silikoneaftryksmaterialet polymeriserer (dette tager ca. 1 min) og fikserer grenen på plads, lukkes ekssikkatoren. Sørg for ikke at efterlade huller.
- Tilslut ekssikkatoren til vakuumpumpen (figur 3).
4. Vakuum infiltration
- Start vakuumpumpen, indtil den kommer til -0,07 MPa.
- Når den når dette tryk, skal du lukke trykventilen og slukke for vakuumpumpen. Hold dette tryk i 5 min.
- Åbn trykventilen for at genoprette kammertrykket.
BEMÆRK: Dette er et kritisk trin. Gendan kammertrykket gradvist og støt. Det kan tage op til 3 minutter at undertrykke ekssikkatoren helt. Udvidet gentryk øger antallet af bakterier, der infiltreres inde i vævet10. - Gentag denne proces to gange mere.
- Tag grenen af cellesuspensionen og ekssikkatoren.
- Rengør de infiltrerede blade med destilleret vand.
5. Inkubation af infiltrerede blade
- Lad de infiltrerede blade forblive under mørke forhold ved 25 °C i 48 timer.
- Udsæt derefter det infiltrerede væv for en 16/8-timers lys / mørk fotoperiode.
- Evaluer den forbigående bladtransformation 3-7 dage efter infektion (DPI).
Figur 1: Kakao forlader udviklingsstadier. (A-E) Udviklingsstadier25. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vakuumkammerkonfiguration og dens komponenter. Vakuumkammeret er en ekssikkator forbundet til en vakuummåler. Pakningen/ O-ringen er skåret, så den har en åbning, hvor grenen skal placeres. (a) vakuummåler, (b) låg, (c) pakning / o-ring, (d) trykventil, (e) tørreapparat, (f) slange. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: I planta vakuum agroinfiltration system. For at undgå vakuumtab under infiltrationsprocessen er det afgørende at fastgøre grenen til ekssikkatoren og pakningen/O-ringen med silikoneaftryksmateriale. (A) Kakaoplante, (B) Vakuumkammer, (C) Silikone indtryksmateriale, (D) Blade nedsænket på Agrobacterium suspension, (E) Vakuumpumpe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol præsenterer en effektiv agroinfiltrationsmetode til store træagtige planter. Med denne protokol var vi i stand til at opnå et vakuumtryk på -0,07 MPa, hvilket resulterede i effektiv, lokaliseret infiltration af kakaoblade. I figur 4 observerer vi infiltrationssystemets opsætningsproces og i figur 5 den endelige konfiguration.
Figur 4: Opsætning af vakuumkammer. (A) Bemærk grenens placering mellem pakningens to ender. Denne pakning er stor nok til, at grenen kan passere igennem mellem ekssikkatoren og dens låg. Bemærk, at der er huller dannet på grund af grenens uregelmæssige overflade. (B) Grenen fastgøres på ekssikkatoren, og de dannede huller fyldes med silikoneaftryksmaterialet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Opsætning af vakuuminfiltrationssystem. Eksempel på opsætning af vakuuminfiltrationssystemet til et stort kakaoanlæg ved hjælp af den foreslåede protokol. Klik her for at se en større version af denne figur.
I den første fase af agroinfiltration udsættes vævet for reduceret tryk, hvilket får gasser til at blive frigivet fra stomatale hulrum og tilstødende mesofylluftrum gennem stomata og gennem sårene. Små bobler på overfladen af bladene nedsænket i Agrobacterium-suspensionen kan ses med det blotte øje, når vakuumet øges. Det næste skridt er at undertrykke vævene og tvinge Agrobacterium-suspensionen inde for at fylde tomrummet efterladt af luften11. Infiltrerede blade ser mørkere ud i nogle områder (figur 6). Dette indikerer, at Agrobacterium-suspensionen har trængt ind i vævet og spredt sig igennem og fyldt bladets intercellulære rum8.
Figur 6: Abaxial visning af voksne kakaoblade efter afslutning af vakuum agroinfiltration. Klik her for at se en større version af denne figur.
Denne protokol opnåede agroinfiltration på lokaliserede blade af store kakaoplanter. Ved at gøre dette transformerede vi forbigående store kakaoplanter med en vektor, der bærer 35S:RUBY som reportersystem. Vi fandt dette reportersystem en nyttig indikator for vellykket forbigående transformation i kakao, fordi akkumuleringen af betalainer i bladene indikerer effektiviteten af transformationen. Betalainer er lyse røde pigmenter, der producerer et umiskendeligt signal på de grønne blade, der kan observeres med det blotte øje (figur 7). Da bladene er fastgjort til planten, kan betalainer ophobes, hvis det infiltrerede væv opretholder sin levedygtighed. Figur 8 viser en række resultater, der varierer fra en høj til en lav betalain-akkumulering på transformerede kakaoblade i trin C. Det er værd at nævne, at dette er den første i planta forbigående transformation rapporteret om denne art.
Figur 7: Kakaoblade forbigående omdannet til overekspression 35S: RUBY. Røde pletter på kakaoblade som følge af betalain-akkumulering er en enkel og hurtig måde at evaluere den foreslåede protokol for lokaliseret vakuumbaseret agroinfiltration i planta. Billede ved 6 DPI, skalalinje: 1 cm, optisk zoom: 8x. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Ophobning af betalain på kakaoblade. Forskellige niveauer og mønstre af betalainakkumulering på kakaoblade ved 6 DPI ved Agrobacterium-medieret forbigående transformation med RUBY-reporteren. Vægtstang: 1 cm, Optisk zoom: 8x. Klik her for at se en større version af denne figur.
| LB Mellem | YM Medium | |
| Gærekstrakt | 5 g/l | 0,4 g/l |
| Trypton enzymatisk fordøjelse fra kasein | 10 g/l | |
| NaCl | 5 g/l | 0,1 g/L |
| Mannitol | 10 g/l | |
| MgSO4·7h20 | 0,204 g/l | |
| K2HPO4 | 0,38 g/l | |
| MES | 1,95 g/l (10 mM) | 1,95 g/l (10 mM) |
| MgCl2 |
Tabel 1: Sammensætning af YM- og LB-medier.
Supplerende figur 1: Repræsentativt billede af tvungen agroinfiltration på kakaoblade ved hjælp af en kanylefri sprøjte. Sprøjteinfiltration resulterede ikke i RUBY-ekspression i bladene, der var synlige med det blotte øje, men resulterede i skader på det punkt, hvor trykket blev påført med den kanyleløse sprøjte. Billede ved 6 dpi, skalalinje: 5 mm, optisk zoom: 25x. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbejde præsenterede vi en effektiv, billig agroinfiltrationsprotokol til in planta forbigående transformation af træagtige planter ved hjælp af kakaoplanter som et eksempel. I betragtning af den velkendte begrænsning, som bladernes neglebånd repræsenterer for omdannelsen af plantevæv, koncentrerede vi os om at udvikle en strategi til at lette agroinfiltration ved vakuum i træagtige planter, som normalt er genstridige over for denne procedure.
Det opnåede vakuumtryk inde i vakuumkammeret var kun muligt på grund af den effektive forsegling og påfyldning af de små huller, der blev skabt mellem ekssikkatoren, trægrenen, pakningen/O-ringen og ekssikkatorens låg, hvilket var protokollens største udfordring. Af denne grund er det vigtigt at bruge silikoneaftryksmateriale til at fastgøre grenen på ekssikkatoren. Dette materiale er ikke-porøst, viser sig at være klæbrigt nok til at klæbe grenen til ekssikkatoren og pakningen og er kemisk inaktivt, så hverken den infiltrerede gren eller ekssikkatoren er beskadiget.
Derudover er det nødvendigt at bruge en vakuumpumpe til at opnå en trykgradient inde i bladsektionen, hvilket får luft til at blive suget ud af stomatalhulen og mesofylområderne, så skubber en stor trykgradient under repressurisering Agrobacterium-suspensionen ind i bladet gennem stomata og sår10. Vi brugte en frysetørrer som vakuumpumpe. Dette er et eksempel på denne protokols alsidighed og tilpasningsevne til ethvert laboratoriums behov. Ved hjælp af frysetørreren som vakuumpumpe tog det ca. 3 minutter at nå -0,07 MPa. Dette er effektivt for kakao, da tidligere forfattere også har vakuuminfiltreret kakaoløsrevne blade med samme vakuumtryk25. Dette er den foretrukne infiltrationsmetode, da den er mere repeterbar end ikke-assisteret eller nåleløs sprøjteinfiltration (supplerende figur 1). Når der anvendes en vakuumpumpe til vakuuminfiltration, kan brugeren styre det tryk og den tid, som vævene udsættes for vakuum10.
I andre planter, som poppel, er det blevet undersøgt, at bladstruktur kan påvirke infiltrationseffektiviteten på grund af arrangementet af mesofylcellerne. De forskellige og variable arrangementer af disse celler kan resultere i en ujævn infiltration af Agrobacterium-suspensionen 8,27, da bladets indre struktur har intercellulære luftspalter8. Selvom spontan infiltration gennem bladets stomata kan ske, når bladene nedsænkes i en Agrobacterium-suspension, er atmosfærisk tryk ikke effektivt nok til at overvinde epidermal neglebånd og fortrænge disse luftrum med bakteriesuspensionen; dette er blevet forsøgt med andre genstridige arter som Persea americana18. Af denne grund viser tvungen vakuummedieret agroinfiltration sig at være en effektiv metode til at lette stofindtrængning i bladene gennem stomata eller sår10. Inokulation af unge kakaoplanter med badnavirus kakao hævet skyde Ghana M-virus infektiøs klon ved biolistisk podning og agroinokulation er for nylig blevet rapporteret28. I kakao udføres de fleste forbigående transformationsanalyser på løsrevne blade25,29, hvilket resulterer i reduceret transient ekspressionsvedligeholdelse på grund af nedbrydning af plantematerialet. Så vidt vi ved, er der ingen rapporter om en forbigående genetisk transformation på kakaoplanter. Her opnåede vi den første forbigående transformation af kakao, og tidligere opnåede vores samme studiegruppe dette i Persea americana18, hvilket gør dette til en levedygtig metode til mulig lokaliseret in vivo-analyse af metabolitter eller molekyler, der kun udtrykkes på blade.
Transient transformation med 35S: RUBY-vektoren blev bekræftet af den forbigående ekspression af betalainer på kakaobladene. Denne vektor rekonstituerer betalain biosyntetiske vej på planter, der ikke naturligt producerer disse pigmenter. Kun nogle Caryophyllales kan naturligt biosyntetisere betalainer fra tyrosin med deres egne metaboliske veje30. For at replikere denne metabolisme indeholder 35S:RUBY den genetiske information til heterolog ekspression af tre enzymer, der omdanner den almindeligt forekommende aminosyre tyrosin til betalainer7.
I planta har forbigående transformationsprotokoller mange fordele i forhold til stabile transformationsprotokoller, herunder hurtigere, omkostningseffektiv og forbedret transformationseffektivitet31. Desuden kan der i planta anvendes forbigående transformation til mange funktionelle genomanalyser32. Funktionelle genomundersøgelser af kakao sigter mod at løse denne arts sygdomsmodtagelighed for mange patogener, såsom Moniliophthora perniciosa og Phytophthora spp33, øge deres tørkebestandighed34 og forbedre dens organoleptiske egenskaber35. Denne protokol har potentiale til at forbedre og uddybe kakaofunktionelle genomforskningsundersøgelser, da den muliggør en forbigående transformation i planta på store kakaotræer eller endda i andre store genstridige og flerårige plantearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingen interessekonflikt at erklære.
Acknowledgments
Vi takker Lic. Jesús Fuentes González og Néstor Iván Robles Olivares for deres hjælp med at filme videooptagelserne. Vi anerkender de generøse gaver fra Dr. Antonia Gutierrez Mora fra CIATEJ (Theobroma kakaoplanter ). Vi takker også CIATEJ og Laboratorio Nacional PlanTECC, México, for facilitetsstøtte. H.E.H.D. (CVU: 1135375) gennemførte masterstudier med finansiering fra Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México (CONAHCYT). R.U.L. anerkender støtte fra Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL) og Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Jalisco, México (tilskud 7270-2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S:RUBY plasmid | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
| 1 mm electroporation cuvette | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus |
| Desiccator | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | For YM medium add 0.38 g/L |
| LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | For YM medium add 10 g/L |
| MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM) |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM) |
| MgSO4·7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | For YM medium add 0.204 g/L |
| MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| President Silicone Impression material | COLTENE | 60019938 | |
| Rifampicin | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg/mL) |
| Silicone Impression material gun | Andent | TBT06 | |
| Spectinomycin | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
| Streptomycin | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
| Tryptone enzymatic digest from casein | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | For LB medium add 10 g/L |
| Yeast extract | MCD LAB | 9031 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L |
References
- Huang, L. Q. Functional Genome of Medicinal Plants. Molecular Pharmacognosy. , Springer, Singapore. (2019).
- Janssen, B. J., Gardner, R. C. Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium. Plant Molecular Biology. 14 (1), 61-72 (1990).
- Wang, X., et al. Identification and functional analysis of in vivo phosphorylation sites of the Arabidopsis BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1 receptor kinase. Plant Cell. 17 (6), 1685-1703 (2005).
- Pan, Z., et al. In vivo assembly of the sorgoleone biosynthetic pathway and its impact on agroinfiltrated leaves of Nicotiana benthamiana. The New Phytologist. 230 (2), 683-697 (2021).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an agrobacterium-mediated method: Applications for gene expression and silencing studies. Nature Protocols. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Guo, M., Ye, J., Gao, D., Xu, N., Yang, J. Agrobacterium-mediated horizontal gene transfer: Mechanism, biotechnological application, potential risk and forestalling strategy. Biotechnology Advances. 37 (1), 259-270 (2019).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).
- Zheng, L., et al. An improved and efficient method of Agrobacterium syringe infiltration for transient transformation and its application in the elucidation of gene function in poplar. BMC Plant Biology. 21 (1), 54 (2021).
- Leuzinger, K., et al. Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 77, 50521 (2013).
- Chincinska, I. A. Leaf infiltration in plant science: old method, new possibilities. Plant Methods. 17 (1), 83 (2021).
- Simmons, C. W., Vandergheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102 (3), 965-970 (2009).
- Cao, D. V., et al. Optimization of Agrobacterium -mediated transient expression of heterologous genes in spinach. Plant Biotechnology Reports. 11, 397-405 (2017).
- Xie, L., et al. Virus-induced gene silencing in the perennial woody Paeonia ostii. PeerJ. 7, ee7001 (2019).
- Prasad Babu, K., Maligeppagol, M., Asokan, R., Krishna Reddy, M. Screening of a multi-virus resistant RNAi construct in cowpea through transient vacuum infiltration method. Virusdisease. 30 (2), 269-278 (2019).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. Two MARK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (6), 905-917 (2003).
- Deng, X., et al. Virus-induced gene silencing for Asteraceae-a reverse genetics approach for functional genomics in Gerbera hybrida. Plant Biotechnology Journal. 10 (8), 970-978 (2012).
- Wang, F., et al. Use of TRV-mediated VIGS for functional genomics research in citrus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 139 (3), 609-613 (2019).
- Salazar-González, J. A., et al. In-planta transient transformation of avocado (Persea americana) by vacuum agroinfiltration of aerial plant parts. Plant Cell Tissue Organ Cult. 152, 635-646 (2023).
- Bio-Rad. MicroPulserTM electroporation apparatus operating instructions and applications guide. The Bio-Rad Literature Library, Rev B Bulletin# M4006174 at. , www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4006174B.pdf (2010).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- GoldBio. Electrotransformation of Agrobacterium tumefaciens Protocol. , https://goldbio.com/documents/3906/Electrotransformation%20of%20agrobacterium%20tumefaciens.pdf (2018).
- Lindbo, J. A. TRBO: a high-efficiency tobacco mosaic virus RNA-based overexpression vector. Plant Physiology. 145 (4), 1232-1240 (2007).
- Rajasekaran, K. Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation of Cotton. Transgenic Crops of the World. Curtis, I. S. , Springer, Dordrecht. (2004).
- Llave, C., Kasschau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13401-13406 (2000).
- Fister, A. S., et al. Protocol: transient expression system for functional genomics in the tropical tree Theobroma cacao L. Plant Methods. 12, 19 (2016).
- Jung, S. -K., et al. Agrobacterium tumefaciens mediated transient expression of plant cell wall-degrading enzymes in detached sunflower leaves. Biotechnology Progress. 30 (1), 905-915 (2014).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (2), 259-273 (2005).
- Keith, C. V., Ramos-Sobrinho, R., Marelli, J. -P., Brown, J. K. Construction of an infectious clone of the Badnavirus Cacao Swollen Shoot Ghana M Virus and infectivity by gene gun- and Agrobacterium-mediated inoculation. Frontiers in Agronomy. 3, 774863 (2021).
- Fister, A. S., Landherr, L., Maximova, S. N., Guiltinan, M. J. Transient expression of CRISPR/Cas9 machinery targeting TcNPR3 enhances defense response in Theobroma cacao. Frontiers in Plant Science. 9, 268 (2018).
- Grützner, R., et al. Engineering betalain biosynthesis in tomato for high level betanin production in fruits. Frontiers in Plant Science. 12, 682443 (2021).
- Saifi, S. K., Passricha, N., Tuteja, R., Kharb, P., Tuteja, N. In planta transformation: A smart way of crop improvement. Advancement in Crop Improvement Techniques. 21, 351-362 (2020).
- Huda, K. M., et al. OsACA6, a P-type IIB Ca2+ ATPase promotes salinity and drought stress tolerance in tobacco by ROS scavenging and enhancing the expression of stress-responsive genes. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 76 (6), 997-1015 (2013).
- Micheli, F., et al.
- Bailey, B. A., et al. Fungal and plant gene expression during the colonization of cacao seedlings by endophytic isolates of four Trichoderma species. Planta. 224 (6), 1449-1464 (2006).
- Motamayor, J. C., et al. Geographic and genetic population differentiation of the Amazonian chocolate tree (Theobroma cacao L). PLoS ONE. 3 (10), e3311 (2008).
