Summary
Qui presentiamo il primo protocollo per l'infiltrazione sottovuoto localizzata per studi in vivo della trasformazione genetica di piante di grandi dimensioni. Utilizzando questa metodologia, abbiamo ottenuto per la prima volta la trasformazione transitoria del cacao mediata da Agrobacterium in planta .
Abstract
La trasformazione transitoria delle piante è un'alternativa rapida ed economica alla trasformazione genetica delle piante. La maggior parte dei protocolli per la trasformazione in planta si basa sull'uso della trasformazione mediata da Agrobacterium. Tuttavia, i protocolli attualmente in uso sono standardizzati per impianti di piccole dimensioni a causa dei vincoli fisici ed economici di sottoporre impianti di grandi dimensioni a un trattamento sottovuoto. Questo lavoro presenta un protocollo efficace per l'agroinfiltrazione localizzata sottovuoto personalizzata per impianti di grandi dimensioni. Per valutare l'efficacia del metodo proposto, ne abbiamo testato l'uso nelle piante di cacao, una specie vegetale tropicale recalcitrante alla trasformazione genetica. Il nostro protocollo ha permesso di applicare fino a 0,07 MPa di vuoto, con ripetizioni, su una parte aerea localizzata delle foglie di cacao, rendendo possibile l'infiltrazione di Agrobacterium negli spazi intercellulari delle foglie attaccate. Di conseguenza, abbiamo ottenuto il transiente mediato da Agrobacterium nella trasformazione planta delle foglie di cacao attaccate che si esprimono per il sistema reporter RUBY. Questa è anche la prima trasformazione transitoria del cacao mediata da Agrobacterium in planta . Questo protocollo consentirebbe l'applicazione del metodo di agroinfiltrazione basato sul vuoto ad altre specie vegetali con vincoli dimensionali simili e aprirebbe la porta alla caratterizzazione in pianta di geni in specie legnose recalcitranti di grandi dimensioni.
Introduction
I metodi di trasformazione genetica delle piante sono essenziali per testare le funzioni biologiche dei geni e sono particolarmente utili oggi, dato il gran numero di geni non caratterizzati previsti nell'era post-genomica1. Questi metodi possono essere utilizzati per ottenere linee completamente trasformate o per esprimere geni in modo transitorio. La trasformazione stabile si verifica quando il DNA estraneo che l'ospite ha assorbito diventa completamente e irreversibilmente integrato nel genoma dell'ospite e le modificazioni genetiche vengono trasmesse alle generazioni successive. L'espressione transitoria, nota come trasformazione transitoria, si verifica dalle copie multiple di T-DNA trasferite da Agrobacterium nella cellula, che non sono state integrate nel genoma dell'ospite, e raggiunge il picco 2-4 giorni dopo l'infezione2.
Vale la pena notare che i saggi di espressione transitoria sono spesso sufficienti per la caratterizzazione funzionale dei geni e possono offrire diversi vantaggi rispetto alla trasformazione stabile. Ad esempio, la trasformazione transitoria non richiede procedure di rigenerazione basate sulla coltura tissutale. Un altro vantaggio è che è compatibile con l'analisi funzionale dei geni in pianta , esistendo diversi esempi di successo di protocolli ben standardizzati per specie vegetali modello, come Arabidopsis thaliana3 e Nicotiana benthamiana4, ma ancora limitati nelle specie non modello5.
Lo sviluppo di saggi transitori si basa sulla disponibilità di metodi efficienti di trasferimento genico. Per questo, gli approcci più popolari si basano sull'infiltrazione di Agrobacterium , che sfrutta la capacità unica di Agrobacterium di trasferire il DNA alle cellule vegetali6. Un altro strumento utile per queste analisi è l'uso di geni reporter, come le proteine fluorescenti verdi (GFP), la β-glucuronidasi (GUS), la luciferasi o RUBY, tutti impiegati per tracciare gli eventi di trasformazione. Tra questi sistemi reporter, RUBY è attualmente il più facile da visualizzare e si basa sulla conversione della tirosina in betalaine attraverso tre reazioni enzimatiche a gradini. A differenza di altri sistemi reporter, le betalaine risultanti possono essere facilmente osservate come pigmenti dai colori vivaci su tessuti vegetali trasformati senza la necessità di apparecchiature sofisticate o reagenti aggiuntivi7.
Quando si infiltra una sospensione di Agrobacterium nello spazio intercellulare del mesofillo fogliare, il passo più critico per un'agroinfezione di successo è il superamento della barriera fisica imposta dalla cuticola epidermica delle foglie8. Mentre per alcune piante è sufficiente un gradiente di pressione creato con una siringa senza ago (siringa Agroinfiltration) per un'agroinfiltrazione efficiente, come avviene in Nicotiana benthamiana9, altre specie vegetali possono richiedere un gradiente di pressione maggiore come quello creato con l'ausilio di pompe a vuoto10. Nei processi assistiti dal vuoto, l'agroinfiltrazione avviene in due fasi. Nel primo, il vuoto serve a sottoporre il materiale vegetale a una pressione ridotta, forzando il rilascio di gas dagli spazi aerei del mesofillo attraverso stomi e ferite. Quindi, durante una fase di ripressurizzazione, la sospensione di Agrobacterium si infiltra negli spazi intercellulari attraverso gli stomi e le ferite11.
Rispetto all'infiltrazione a siringa, l'infiltrazione sottovuoto consente una maggiore frequenza di utilizzo, ripetibilità e la capacità di controllare la pressione e la durata in ogni fase del processo di infiltrazione10. Nelle foglie di diverse specie vegetali come gli spinaci (Spinacia oleracea)12, la peonia (una pianta legnosa perenne) (Paeonia ostii)13 e il fagiolo dall'occhio (Vigna unguiculata)14, i protocolli di agroinfiltrazione sottovuoto hanno raggiunto un tasso di infiltrazione più profondo rispetto all'infiltrazione a siringa. Allo stesso modo, nel pomodoro (Lycopersicon esculentum)15 e nella gerbera (Gerbera hybrida)16, l'agroinfiltrazione sotto vuoto ha prodotto un silenziamento genico più forte e uniforme rispetto all'infiltrazione con siringa. Un ulteriore vantaggio dell'infiltrazione sottovuoto è la minore dipendenza dal genotipo, rispetto all'infiltrazione a siringa, che è stata osservata recentemente in tre varietà di agrumi (Fortunella obovata, Citrus limon e C. grandis)17. Tuttavia, quando si cerca di applicare l'agroinfiltrazione sottovuoto a piante troppo grandi per essere inserite negli essiccatori, le dimensioni delle camere a vuoto possono essere un limite, come in genere accade con le piante legnose tropicali.
Di seguito, descriviamo un protocollo che supera la limitazione spaziale delle camere a vuoto, testandone l'utilità per la trasformazione in planta transitoria delle foglie di cacao. Presentiamo il primo metodo di infiltrazione sottovuoto localizzato per cacao, che non necessita di attrezzature aggiuntive e consente addirittura l'utilizzo degli stessi essiccatori da laboratorio utilizzati per l'infiltrazione dell'intera pianta, ma con un semplice adattamento che consente l'accesso di una parte della pianta all'interno della camera a vuoto, consentendone l'utilizzo in diverse fasi di sviluppo della pianta. Per testare l'utilità del metodo di infiltrazione sottovuoto localizzato proposto, abbiamo selezionato il cacao come proxy di una specie di pianta tropicale a foglia larga e difficile da trasformare. Utilizzando questo metodo di infiltrazione localizzata, abbiamo recentemente riportato la prima espressione transitoria di planta nell'avocado mediante infiltrazione sottovuoto mediata da Agrobacterium con condizioni precedentemente ottimizzate per foglie staccate18, e qui riportiamo la prima espressione transitoria di planta nel cacao.
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Protocol
1. Coltura di Agrobacterium tumefaciens
- Scongelare le cellule elettrocompetenti del ceppo Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
- Aggiungere 1 mL di Malto Lievitato (YM; Tabella 1) brodo in una provetta di coltura di 17 mm x 100 mm. Conservare questo tubo per dopo e conservarlo a temperatura ambiente (RT).
- In una provetta da 1,5 mL, aggiungere 30 μL di cellule di Agrobacterium scongelate e 100-250 ng (fino a 5 μL) di DNA contenente 35S:RUBY. Mescolare delicatamente.
NOTA: Il 35S:RUBY è stato un regalo di Yunde Zhao. Per evitare la formazione di archi elettrici nel campione, ridurre il più possibile la presenza di composti ionici. Questi composti ionici possono essere sali residui della precipitazione dell'etanolo del DNA19. - A questo punto, posizionare una cuvetta per elettroporazione da 1 mm sul ghiaccio.
- Trasferire la miscela di sospensione precedente in una cuvetta per elettroporazione fredda da 1 mm. Tieni tutto in ghiaccio. Pulire gli elettrodi metallici della cuvetta.
- Impostare l'elettroporatore su Agr (2,2 kV, ~5 ms, 1 impulso). Posizionare la cuvetta all'interno della camera di elettroporazione.
- Premere il pulsante Pulse . Registrare i parametri dell'impulso. Se il campione si è inarcato, il processo di elettroporazione non è riuscito.
NOTA: È fondamentale trasferire rapidamente le cellule nel brodo YM subito dopo l'impulso. Ritardare questo trasferimento può ridurre drasticamente l'efficienza della trasformazione20. - Utilizzare immediatamente il brodo YM risparmiato per trasferire le cellule dalla cuvetta alla provetta da 17 mm x 100 mm. Risospendere delicatamente le cellule.
- Incubare le cellule trasformate per 3 ore a 28 °C e 250 rpm su un incubatore orbitale.
NOTA: Questa coltura non contiene antibiotici; Prestare attenzione alle corrette condizioni asettiche. - Strisciare questa coltura su piastre di agar YM selettive21. Per il ceppo LBA4404-RUBY trasformato, assicurarsi che queste piastre contengano rifampicina (25 μg/mL), spectinomicina (50 μg/mL) e streptomicina (50 μg/mL). Incubare questa piastra per una notte in un'incubatrice permanente a 28 °C.
NOTA: In questo protocollo è stato utilizzato il vettore 35S:RUBY , che conferisce resistenza batterica alla spectinomicina (50 μg/mL) e funziona come reporter visivo sul tessuto vegetale infiltrato. - Inoculare le colonie della coltura notturna su 12,5 mL di una miscela di brodo YM e brodo Luria Bertani (LB) (in proporzione 9:1, rispettivamente), 10 mM di MES, pH 5,722. Assicurarsi che questo terreno liquido selettivo contenga gli stessi antibiotici utilizzati al punto 1.10. Fare riferimento alla Tabella 1 per vedere gli ingredienti e le concentrazioni di questi mezzi.
- Quando si incuba l'Agrobacterium, lasciare uno spazio di aerazione sufficiente per la coltura, circa 4-5 volte il volume del liquido. Utilizzare il brodo YM per LBA4404 del ceppo Agrobacterium per evitare l'aggregazione delle cellule23.
- Incubare la coltura per 16 ore a 250 giri/min su un incubatore orbitale a 28 °C.
- Scalare la coltura fino a 10 volte il volume iniziale con lo stesso terreno utilizzato nel passaggio 1.11.
- Incubare la coltura per 16 ore e 250 rpm su un incubatore orbitale a 28 °C.
- Regolare la coltura notturna su una densità ottica (OD600) di 0,4. Aggiungere 20 μM di acetosiringone (AS).
- Incubare a 250 giri/min su un incubatore orbitale a 28 °C fino a quando OD600 raggiunge circa 1,0.
- Centrifugare le cellule a 4 500 x g per 10 minuti a 20 °C.
- Risospendere il pellet con soluzione di sospensione (10 mM MES, 10 mM MgCl2, pH 5,7), regolando OD600 a 0,6. Aggiungere 200 μM AS24.
NOTA: Pre-incubare la soluzione in sospensione a 28 °C. Se la soluzione di sospensione è fredda quando viene aggiunta, le cellule precipiteranno. - Lasciare agire la sospensione batterica per 2-24 ore al buio e a 25 °C. L'agitazione non è richiesta22.
2. Selezione delle piante
- Scegli una pianta con un ramo con foglie nella fase ottimale per l'agroinfiltrazione.
NOTA: La pianta può essere adulta o matura. Per il cacao si consigliano le foglie giovani dello stadio C. Queste foglie sono di colore da bronzo a verde chiaro; non sono completamente espansi né rigidi come le foglie dello stadio D25 (Figura 1).- Come controllo, eseguire contemporaneamente l'agroinfiltrazione su altre piante (ad esempio, Nicotiana tabacum) con un'elevata efficienza di agroinfiltrazione che viene riportata per il ceppo e il vettore utilizzato.
NOTA: Se non si ottengono risultati positivi in questo controllo, è possibile che i risultati negativi siano dovuti alla deformazione o al vettore utilizzato.
- Come controllo, eseguire contemporaneamente l'agroinfiltrazione su altre piante (ad esempio, Nicotiana tabacum) con un'elevata efficienza di agroinfiltrazione che viene riportata per il ceppo e il vettore utilizzato.
3. Configurazione della camera a vuoto
- Come camera a vuoto, utilizzare un essiccatore dotato di un vacuometro per misurare la pressione del vuoto all'interno.
- Aggiungere 250 μM di acido jasmonico (JA)18,26 alla sospensione di Agrobacterium dal punto 1.19.
- Trasferire la coltura di Agrobacterium in un becher a bocca larga per immergere il ramo e le foglie selezionati. Quindi, posizionare il becher con la coltura di Agrobacterium all'interno dell'essiccatore.
- Posizionare il ramo tra l'essiccatore e il suo coperchio. Assicurati di immergere le foglie desiderate all'interno della coltura di Agrobacterium . Quindi, usa un anello di salto, che è un anello rotondo con un ritaglio che consente al ramo della pianta di entrare nell'essiccatore. L'anello di salto funge anche da distanziatore tra la parte inferiore e superiore dell'essiccatore.
- Assicurarsi che la guarnizione sia strutturalmente abbastanza stabile da evitare di essere schiacciata con il coperchio, abbastanza flessibile da piegarsi e adattarsi alla circonferenza dell'essiccatore e non realizzata in materiale poroso.
NOTA: Questo studio ha utilizzato un filo metallico intrecciato costituito da diversi fili più piccoli attorcigliati insieme, rivestiti con un materiale plastico non poroso simile a una guarnizione (Figura 2). - Per fissare il ramo sull'essiccatore, utilizzare materiale da impronta in silicone. Assicurarsi che il materiale sia appiccicoso, non poroso, chimicamente inerte per l'essiccatore e la pianta e facile da applicare e riempire piccoli spazi tra il ramo, la guarnizione e l'essiccatore.
- Una volta che il materiale da impronta in silicone polimerizza (ci vuole circa 1 minuto) e fissa il ramo in posizione, chiudere l'essiccatore. Assicurati di non lasciare spazi vuoti.
- Collegare l'essiccatore alla pompa del vuoto (Figura 3).
4. Infiltrazione sottovuoto
- Avviare la pompa del vuoto fino a -0,07 MPa.
- Una volta raggiunta questa pressione, chiudere la valvola di pressione e spegnere la pompa del vuoto. Mantenere questa pressione per 5 min.
- Aprire la valvola di pressione per ripristinare la pressione della camera.
NOTA: questo è un passaggio critico. Ripristinare la pressione della camera in modo graduale e costante. Potrebbero essere necessari fino a 3 minuti per ripressurizzare completamente l'essiccatore. La ripressurizzazione prolungata aumenta il numero di batteri infiltrati all'interno del tessuto10. - Ripeti questo processo altre due volte.
- Togliere il ramo dalla sospensione cellulare e dall'essiccatore.
- Pulire le foglie infiltrate con acqua distillata.
5. Incubazione delle foglie infiltrate
- Lasciare le foglie infiltrate al buio a 25 °C per 48 h.
- Quindi, esporre il tessuto infiltrato a un fotoperiodo luce/buio di 16/8 ore.
- Valutare la trasformazione fogliare transitoria 3-7 giorni dopo l'infezione (DPI).
Figura 1: Fasi di sviluppo delle foglie di cacao. (A-E) Fasi di sviluppo25. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Configurazione della camera a vuoto e suoi componenti. La camera a vuoto è un essiccatore collegato a un vacuometro. La guarnizione/O-ring è tagliata in modo da avere un'apertura in cui verrà posizionato il ramo. (A) Vacuometro, (B) Coperchio, (C) Guarnizione/O-ring, (D) Valvola di pressione, (E) Essiccatore, (F) Tubo flessibile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Nel sistema di agroinfiltrazione sottovuoto planta . Per evitare perdite di vuoto durante il processo di infiltrazione, è fondamentale fissare il ramo all'essiccatore e la guarnizione/O-ring con materiale da impronta in silicone. (A) Pianta di cacao, (B) Camera a vuoto, (C) Materiale da impronta in silicone, (D) Foglie immerse in sospensione di Agrobacterium , (E) Pompa a vuoto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
Questo protocollo presenta un efficace metodo di agroinfiltrazione per piante legnose di grandi dimensioni. Con questo protocollo, siamo stati in grado di raggiungere una pressione del vuoto di -0,07 MPa, con conseguente infiltrazione efficace e localizzata delle foglie di cacao. Nella Figura 4, osserviamo il processo di impostazione del sistema di infiltrazione e nella Figura 5, la configurazione finale.
Figura 4: Configurazione della camera a vuoto. (A) Notare il posizionamento del ramo tra le due estremità della guarnizione. Questa guarnizione è abbastanza grande da consentire il passaggio del ramo tra l'essiccatore e il suo coperchio. Osserva che si formano degli spazi vuoti a causa della superficie irregolare del ramo. (B) Il ramo viene fissato sull'essiccatore e gli spazi vuoti formati vengono riempiti con il materiale da impronta in silicone. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Configurazione del sistema di infiltrazione sottovuoto. Esempio di configurazione del sistema di infiltrazione sottovuoto per un impianto di cacao di grandi dimensioni utilizzando il protocollo proposto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Durante la prima fase dell'agroinfiltrazione, il tessuto è sottoposto a una pressione ridotta, che provoca il rilascio di gas dalle cavità stomatiche e dagli spazi d'aria mesofilli adiacenti attraverso gli stomi e attraverso le ferite. Piccole bolle sulla superficie delle foglie immerse nella sospensione di Agrobacterium possono essere viste ad occhio nudo man mano che il vuoto aumenta. Il passo successivo è quello di ripressurizzare i tessuti e forzare la sospensione di Agrobacterium all'interno per riempire il vuoto lasciato dall'aria11. Le foglie infiltrate appaiono di colore più scuro in alcune aree (Figura 6). Ciò indica che la sospensione di Agrobacterium è penetrata nel tessuto e si è diffusa dappertutto, riempiendo gli spazi intercellulari della foglia8.
Figura 6: Vista abassiale delle foglie di cacao adulte dopo il completamento dell'agroinfiltrazione sottovuoto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Questo protocollo ha permesso di ottenere l'agroinfiltrazione su foglie localizzate di piante di cacao di grandi dimensioni. In questo modo, abbiamo trasformato transitoriamente grandi piante di cacao con un vettore che trasporta 35S:RUBY come sistema reporter. Abbiamo trovato questo sistema reporter un utile indicatore del successo della trasformazione transitoria nel cacao perché l'accumulo di betalaine nelle foglie indica l'efficienza della trasformazione. Le betalaine sono pigmenti di colore rosso brillante, che producono un segnale inconfondibile sulle foglie verdi che può essere osservato ad occhio nudo (Figura 7). Poiché le foglie sono attaccate alla pianta, le betalaine possono accumularsi se il tessuto infiltrato mantiene la sua vitalità. La figura 8 mostra una serie di risultati, che variano da un accumulo elevato a uno basso di betalaina sulle foglie di cacao trasformate dello stadio C. Vale la pena ricordare che questa è la prima trasformazione transitoria di planta riportata su questa specie.
Figura 7: Foglie di cacao trasformate transitoriamente in sovraespressione 35S: RUBY. Le macchie rosse sulle foglie di cacao derivanti dall'accumulo di betalaina sono un modo semplice e veloce per valutare il protocollo proposto di agroinfiltrazione localizzata sotto vuoto in planta. Immagine a 6 DPI, barra scala: 1 cm, zoom ottico: 8x. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Accumulo di betalaina sulle foglie di cacao. Diversi livelli e modelli di accumulo di betalaina sulle foglie di cacao a 6 DPI mediante trasformazione transitoria mediata da Agrobacterium con il reporter RUBY. Barra della scala: 1 cm, Zoom ottico: 8x. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| LB Medio | YM Medio | |
| Estratto di lievito | 5 g/L | 0,4 g/L |
| Digesto enzimatico di triptone da caseina | 10 g/L | |
| NaCl | 5 g/L | 0,1 g/L |
| Mannitolo | 10 g/L | |
| MgSO4·7h20 | 0,204 g/L | |
| K2HPO4 | 0,38 g/L | |
| MES | 1,95 g/L (10 mM) | 1,95 g/L (10 mM) |
| MgCl2 |
Tabella 1: Composizione dei substrati YM e LB.
Figura supplementare 1: Immagine rappresentativa dell'agroinfiltrazione forzata su foglie di cacao utilizzando una siringa senza ago. L'infiltrazione della siringa non ha provocato l'espressione di RUBY nelle foglie visibili ad occhio nudo, ma ha provocato danni nel punto in cui è stata applicata la pressione con la siringa senza ago. Immagine a 6 DPI, barra scalata: 5 mm, zoom ottico: 25x. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
In questo lavoro, abbiamo presentato un protocollo di agroinfiltrazione efficiente e a basso costo per la trasformazione transitoria in planta di piante legnose, utilizzando come esempio le piante di cacao. Dato il ben noto vincolo che la cuticola delle foglie rappresenta per la trasformazione dei tessuti vegetali, ci siamo concentrati sullo sviluppo di una strategia per facilitare l'agroinfiltrazione sottovuoto nelle piante legnose, che solitamente sono recalcitranti a questa procedura.
La pressione del vuoto raggiunta all'interno della camera a vuoto è stata possibile solo grazie all'efficiente sigillatura e riempimento dei piccoli spazi vuoti creati tra l'essiccatore, il ramo dell'albero, la guarnizione/O-ring e il coperchio dell'essiccatore, che è stata la sfida principale del protocollo. Per questo motivo, è fondamentale utilizzare materiale da impronta in silicone per fissare il ramo sull'essiccatore. Questo materiale non è poroso, risulta essere abbastanza appiccicoso da far aderire il ramo all'essiccatore e alla guarnizione ed è chimicamente inerte, quindi né il ramo infiltrato né l'essiccatore vengono danneggiati.
Inoltre, è necessario utilizzare una pompa a vuoto per ottenere un gradiente di pressione all'interno della sezione fogliare, provocando l'aspirazione dell'aria dalla cavità stomatica e dalle regioni del mesofillo, quindi un grande gradiente di pressione durante la ripressurizzazione spinge la sospensione di Agrobacterium nella foglia attraverso stomi e ferite10. Abbiamo usato un liofilizzatore come pompa per vuoto. Questo è un esempio della versatilità e dell'adattabilità di questo protocollo alle esigenze di ogni laboratorio. Utilizzando il liofilizzatore come pompa per vuoto, ci sono voluti circa 3 minuti per raggiungere -0.07 MPa. Questo è efficace per il cacao poiché gli autori precedenti hanno anche infiltrato sottovuoto foglie di cacao staccate con la stessa pressione di vuoto25. Questo è il metodo di infiltrazione preferito poiché è più ripetibile rispetto all'infiltrazione con siringa non assistita o senza ago (Figura 1 supplementare). Quando si utilizza una pompa per vuoto per l'infiltrazione del vuoto, l'utente può controllare la pressione e il tempo in cui i tessuti sono esposti al vuoto10.
In altre piante, come il pioppo, è stato studiato che la struttura fogliare può influenzare l'efficienza di infiltrazione a causa della disposizione delle cellule del mesofillo. La diversa e variabile disposizione di queste cellule può provocare un'infiltrazione irregolare da parte della sospensione di Agrobacterium 8,27 poiché la struttura interna della foglia presenta intercapedini d'aria8. Sebbene l'infiltrazione spontanea attraverso gli stomi delle foglie possa avvenire quando si immergono le foglie in una sospensione di Agrobacterium, la pressione atmosferica non è abbastanza efficace per superare la cuticola epidermica e spostare questi spazi aerei con la sospensione batterica; questo è stato provato con altre specie recalcitranti come Persea americana18. Per questo motivo, l'agroinfiltrazione forzata mediata dal vuoto si rivela un metodo efficace per facilitare la penetrazione della sostanza nelle foglie attraverso gli stomi o le ferite10. Recentemente è stata segnalata l'inoculazione di giovani piantine di cacao con il clone infettivo del virus Ghana M del germoglio gonfio del cacao badnavirus mediante inoculazione biolistica e agroinoculazione28. Nel cacao, la maggior parte dei saggi di trasformazione transitoria vengono eseguiti su foglie staccate25,29, con conseguente riduzione del mantenimento dell'espressione transitoria a causa della degradazione del materiale vegetale. Per quanto ne sappiamo, non ci sono segnalazioni di trasformazioni genetiche transitorie in planta sulle piante di cacao. Qui, abbiamo ottenuto la prima trasformazione transitoria del cacao e, in precedenza, il nostro stesso gruppo di studio l'ha ottenuta in Persea americana18, rendendo questa una metodologia praticabile per una possibile analisi localizzata in vivo di metaboliti o molecole che sono espressi solo sulle foglie.
La trasformazione transitoria con il vettore 35S:RUBY è stata confermata dall'espressione transitoria di betalaine sulle foglie di cacao. Questo vettore ricostituisce la via biosintetica della betalaina su piante che non producono naturalmente questi pigmenti. Solo alcuni Caryophyllales possono biosintetizzare naturalmente le betalaine della tirosina con le proprie vie metaboliche30. Per replicare questo metabolismo, 35S:RUBY contiene l'informazione genetica per l'espressione eterologa di tre enzimi che convertono l'amminoacido tirosina comunemente presente in betalaine7.
In planta i protocolli di trasformazione transitoria presentano molti vantaggi rispetto ai protocolli di trasformazione stabili, tra cui un'efficienza di trasformazione più rapida, economica e migliorata31. Inoltre, nelle piante una trasformazione transitoria può essere applicata per molte analisi di genomica funzionale32. Gli studi di genomica funzionale sul cacao mirano a risolvere la suscettibilità di questa specie a molti patogeni, come Moniliophthora perniciosa e Phytophthora spp33, ad aumentarne la resistenza alla siccità34 e a migliorarne le qualità organolettiche35. Questo protocollo ha il potenziale per migliorare e approfondire gli studi di genomica funzionale del cacao poiché rende possibile in pianta una trasformazione transitoria su alberi di cacao di grandi dimensioni o anche in altre grandi specie vegetali recalcitranti e perenni.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.
Acknowledgments
Ringraziamo Lic. Jesús Fuentes González e Néstor Iván Robles Olivares per la loro assistenza nelle riprese del filmato. Riconosciamo le generose donazioni della Dott.ssa Antonia Gutierrez Mora di CIATEJ (piante di Theobroma cacao ). Ringraziamo anche CIATEJ e Laboratorio Nacional PlanTECC, Messico, per il supporto alla struttura. H.E.H.D. (CVU: 1135375) ha condotto studi di master con il finanziamento del Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, Messico (CONAHCYT). R.U.L. riconosce il sostegno del Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL) e della Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Jalisco, Messico (Grant 7270-2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S:RUBY plasmid | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
| 1 mm electroporation cuvette | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus |
| Desiccator | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | For YM medium add 0.38 g/L |
| LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | For YM medium add 10 g/L |
| MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM) |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM) |
| MgSO4·7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | For YM medium add 0.204 g/L |
| MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| President Silicone Impression material | COLTENE | 60019938 | |
| Rifampicin | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg/mL) |
| Silicone Impression material gun | Andent | TBT06 | |
| Spectinomycin | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
| Streptomycin | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
| Tryptone enzymatic digest from casein | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | For LB medium add 10 g/L |
| Yeast extract | MCD LAB | 9031 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L |
References
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