Summary
Hier stellen wir das erste Protokoll für die lokalisierte Vakuuminfiltration für in vivo-Studien zur genetischen Transformation von Großpflanzen vor. Mit dieser Methodik haben wir zum ersten Mal die Agrobacterium-vermittelte transiente Transformation von Kakao erreicht.
Abstract
Die transiente in planta-Transformation ist eine schnelle und kostengünstige Alternative zur pflanzengenetischen Transformation. Die meisten Protokolle für die In-planta-Transformation basieren auf der Verwendung von Agrobacterium-vermittelter Transformation. Die derzeit verwendeten Protokolle sind jedoch aufgrund der physikalischen und wirtschaftlichen Einschränkungen, die mit einer Vakuumbehandlung verbunden sind, für kleine Anlagen standardisiert. Diese Arbeit stellt ein effektives Protokoll für die lokalisierte vakuumbasierte Agroinfiltration vor, das auf große Pflanzen zugeschnitten ist. Um die Wirksamkeit der vorgeschlagenen Methode zu bewerten, testeten wir ihre Anwendung in Kakaopflanzen, einer tropischen Pflanzenart, die gegen genetische Transformation resistent ist. Unser Protokoll ermöglichte es, ein Vakuum von bis zu 0,07 MPa mit Wiederholungen auf einen lokalisierten oberirdischen Teil der Kakaoblätter anzuwenden, wodurch es möglich wurde, die Infiltration von Agrobacterium in die Interzellularräume der anhaftenden Blätter zu erzwingen. Als Ergebnis erreichten wir die Agrobacterium-vermittelte transiente in planta-Transformation von anhaftenden Kakaoblättern, die für das RUBY-Reportersystem exprimiert werden. Dies ist auch die erste Agrobacterium-vermittelte transiente Umwandlung von Kakao in planta . Dieses Protokoll würde die Anwendung der vakuumbasierten Agroinfiltrationsmethode auf andere Pflanzenarten mit ähnlichen Größenbeschränkungen ermöglichen und die Tür für die In-planta-Charakterisierung von Genen in widerspenstigen holzigen, großformatigen Arten öffnen.
Introduction
Pflanzengenetische Transformationsmethoden sind unerlässlich, um die biologischen Funktionen von Genen zu testen, und sind heute besonders nützlich angesichts der großen Anzahl uncharakterisierter Gene, die in der postgenomischen Äravorhergesagt wurden 1. Diese Methoden können verwendet werden, um vollständig transformierte Linien zu erhalten oder Gene vorübergehend zu exprimieren. Eine stabile Transformation tritt auf, wenn die fremde DNA, die der Wirt aufgenommen hat, vollständig und irreversibel in das Wirtsgenom integriert wird und die genetischen Veränderungen an nachfolgende Generationen weitergegeben werden. Die vorübergehende Expression, die als vorübergehende Transformation bezeichnet wird, erfolgt aus den mehreren Kopien der T-DNA, die von Agrobacterium in die Zelle übertragen werden und nicht in das Wirtsgenom integriert wurden, und erreicht 2-4 Tage nach der Infektion ihren Höhepunkt2.
Es ist erwähnenswert, dass transiente Expressionsassays oft für die funktionelle Charakterisierung von Genen ausreichen und mehrere Vorteile gegenüber einer stabilen Transformation bieten können. Beispielsweise erfordert die transiente Transformation keine gewebekulturbasierten Regenerationsverfahren. Ein weiterer Vorteil ist, dass es mit der funktionellen Analyse von Genen in planta kompatibel ist, die mehrere erfolgreiche Beispiele von Protokollen gibt, die für Modellpflanzenarten wie Arabidopsis thaliana3 und Nicotiana benthamiana4 gut standardisiert sind, aber bei Nicht-Modellarten5 immer noch begrenzt sind.
Die Entwicklung transienter Assays hängt von der Verfügbarkeit effizienter Gentransfermethoden ab. Die beliebtesten Ansätze basieren dabei auf der Agrobacterium-Infiltration , die sich die einzigartige Fähigkeit von Agrobacterium zunutze macht, DNA auf Pflanzenzellen zu übertragen6. Ein weiteres nützliches Werkzeug für diese Analysen ist die Verwendung von Reportergenen wie grün fluoreszierenden Proteinen (GFP), β-Glucuronidase (GUS), Luciferase oder RUBY, die alle zur Verfolgung von Transformationsereignissen eingesetzt werden. Unter diesen Reportersystemen ist RUBY derzeit am einfachsten zu visualisieren und beruht auf der Umwandlung von Tyrosin in Betalaine durch drei enzymatische Stufenreaktionen. Im Gegensatz zu anderen Reportersystemen können die resultierenden Betalaine leicht als hell gefärbte Pigmente auf transformiertem Pflanzengewebe beobachtet werden, ohne dass ausgeklügelte Geräte oder zusätzliche Reaktanten erforderlich sind7.
Bei der Infiltration einer Agrobacterium-Suspension in den interzellulären Raum des Blattmesophylls ist der kritischste Schritt für eine erfolgreiche Agroinfektion die Überwindung der physikalischen Barriere, die durch die epidermale Kutikula der Blätter auferlegt wird8. Während bei einigen Pflanzen ein mit einer nadellosen Spritze erzeugter Druckgradient (Spritzen-Agroinfiltration) für eine effiziente Agroinfiltration ausreicht, wie es bei Nicotiana benthamiana9 der Fall ist, benötigen andere Pflanzenarten möglicherweise einen größeren Druckgradienten, wie er mit Hilfe von Vakuumpumpen10 erzeugt wird. Bei vakuumunterstützten Prozessen erfolgt die Agroinfiltration in zwei Schritten. Im ersten Fall dient das Vakuum dazu, das Pflanzenmaterial einem reduzierten Druck auszusetzen, wodurch die Freisetzung von Gasen aus den mesophyllen Lufträumen durch Spaltöffnungen und Wunden erzwungen wird. Dann infiltriert die Agrobacterium-Suspension während einer Druckentlastungsphase die Interzellularräume über die Spaltöffnungen und Wunden11.
Im Vergleich zur Spritzeninfiltration ermöglicht die Vakuuminfiltration eine höhere Nutzungshäufigkeit, Wiederholbarkeit und die Möglichkeit, Druck und Dauer in jeder Phase des Infiltrationsprozesses zu kontrollieren10. In Blättern verschiedener Pflanzenarten wie Spinat (Spinacia oleracea)12, Pfingstrose (eine holzige Staude) (Paeonia ostii)13 und Kuherbse (Vigna unguiculata)14 erreichten Vakuum-Agroinfiltrationsprotokolle eine tiefere Infiltrationsrate als Spritzeninfiltration. In ähnlicher Weise führte die Vakuum-Agroinfiltration bei Tomaten (Lycopersicon esculentum)15 und Gerbera (Gerbera hybrida)16 zu einem stärkeren und gleichmäßigeren Gen-Silencing als bei der Spritzeninfiltration. Ein weiterer Vorteil der Vakuuminfiltration ist die geringere Abhängigkeit vom Genotyp im Vergleich zur Spritzeninfiltration, die kürzlich bei drei Zitrussorten (Fortunella obovata, Citrus limon und C. grandis) beobachtet wurde17. Wenn Sie jedoch versuchen, die Vakuum-Agroinfiltration auf Pflanzen anzuwenden, die zu groß sind, um in Exsikkatoren zu passen, kann die Größe der Vakuumkammern eine Einschränkung darstellen, wie es typischerweise bei tropischen Gehölzen der Fall ist.
Im Folgenden beschreiben wir ein Protokoll, das die räumliche Begrenzung von Vakuumkammern überwindet und seinen Nutzen für die transiente Transformation von Kakaoblättern in planta testet. Wir präsentieren die erste lokalisierte Vakuuminfiltrationsmethode für Kakao, die keine zusätzliche Ausrüstung erfordert und sogar die Verwendung der gleichen Laborexsikkatoren ermöglicht, die für die Infiltration der gesamten Pflanze verwendet werden, jedoch mit einer einfachen Anpassung, die den Zugang zu einem Teil der Pflanze in der Vakuumkammer ermöglicht und den Einsatz in verschiedenen Stadien der Pflanzenentwicklung ermöglicht. Um die Nützlichkeit der vorgeschlagenen lokalisierten Vakuuminfiltrationsmethode zu testen, wählten wir Kakao als Stellvertreter einer großblättrigen tropischen Pflanzenart, die schwer zu transformieren ist. Mit dieser lokalisierten Infiltrationsmethode berichteten wir kürzlich über die erste transiente Expression von planta in Avocado durch Agrobacterium-vermittelte Vakuuminfiltration mit Bedingungen, die zuvor für abgelöste Blätter optimiert waren18, und hier berichten wir über die erste transiente Expression von planta in Kakao.
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Protocol
1. Agrobacterium tumefaciens-Kultur
- Elektrokompetente Zellen von Agrobacterium tumefaciens Stamm LBA4404 auftauen.
- Fügen Sie 1 ml Hefemalz (YM; Tabelle 1) Brühe in ein 17 mm x 100 mm großes Kulturröhrchen. Bewahren Sie dieses Röhrchen für später auf und bewahren Sie es bei Raumtemperatur (RT) auf.
- In ein 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen 30 μl der aufgetauten Agrobacterium-Zellen und 100-250 ng (bis zu 5 μl) der DNA mit 35S:RUBY geben. Vorsichtig mischen.
HINWEIS: Der 35S:RUBY war ein Geschenk von Yunde Zhao. Um Probenlichtbögen zu vermeiden, reduzieren Sie das Vorhandensein ionischer Verbindungen so weit wie möglich. Diese ionischen Verbindungen können Restsalze aus der Ethanolfällung von DNA19 sein. - Legen Sie an dieser Stelle eine 1 mm Elektroporationsküvette auf Eis.
- Die vorherige Suspensionsmischung in eine gekühlte 1 mm Elektroporationsküvette geben. Halten Sie alles auf Eis. Wischen Sie die metallischen Elektroden der Küvette ab.
- Stellen Sie den Elektroporator auf Agr (2,2 kV, ~5 ms, 1 Impuls). Legen Sie die Küvette in die Elektroporationskammer.
- Drücken Sie die Pulse-Taste. Registrieren Sie die Impulsparameter. Wenn die Probe einen Lichtbogen bildete, versagte der Elektroporationsprozess.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Zellen direkt nach dem Impuls schnell in die YM-Brühe zu überführen. Eine Verzögerung dieser Übertragung kann die Transformationseffizienz drastisch verringern20. - Verwenden Sie sofort die gespeicherte YM-Bouillon, um die Zellen von der Küvette in das 17 mm x 100 mm große Rohr zu übertragen. Resuspendieren Sie die Zellen sanft.
- Inkubieren Sie die transformierten Zellen 3 Stunden lang bei 28 °C und 250 U/min in einem Orbitalinkubator.
HINWEIS: Diese Kultur enthält keine Antibiotika; Seien Sie vorsichtig mit den richtigen aseptischen Bedingungen. - Streifen Sie diese Kultur auf selektive YM-Agarplatten21. Stellen Sie für den transformierten LBA4404-RUBY-Stamm sicher, dass diese Platten Rifampicin (25 μg/ml), Spectinomycin (50 μg/ml) und Streptomycin (50 μg/ml) enthalten. Inkubieren Sie diese Platte über Nacht in einem 28 °C stehenden Inkubator.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurde der Vektor 35S:RUBY verwendet, der eine bakterielle Resistenz gegen Spectinomycin (50 μg/ml) verleiht und als visueller Reporter auf infiltriertem Pflanzengewebe fungiert. - Beimpfen Sie die Kolonien aus der Übernachtkultur mit 12,5 ml einer Mischung aus YM-Bouillon und Luria Bertani (LB)-Bouillon (im Verhältnis 9:1), 10 mM MES, pH 5,722. Es ist sicherzustellen, dass dieses selektive flüssige Medium die gleichen Antibiotika enthält, die in Schritt 1.10 verwendet wurden. In Tabelle 1 finden Sie die Inhaltsstoffe und Konzentrationen für diese Medien.
- Lassen Sie bei der Inkubation von Agrobacterium genügend Belüftungsraum für die Kultur, etwa das 4- bis 5-fache des Flüssigkeitsvolumens. Verwenden Sie YM-Bouillon für Agrobacterium-Stamm LBA4404, um Zellverklumpungen zu vermeiden23.
- Inkubieren Sie die Kultur 16 Stunden lang bei 250 U/min auf einem 28 °C Orbitalinkubator.
- Skalieren Sie die Kultur auf das 10-fache des ursprünglichen Volumens mit dem gleichen Medium, das in Schritt 1.11 verwendet wurde.
- Inkubieren Sie die Kultur für 16 h und 250 U/min auf einem 28 °C Orbitalinkubator.
- Stellen Sie die Übernachtkultur auf eine optische Dichte (OD600) von 0,4 ein. Fügen Sie 20 μM Acetosyringon (AS) hinzu.
- Inkubieren Sie bei 250 U/min auf einem 28 °C Orbitalinkubator, bis OD600 etwa 1,0 erreicht.
- Die Zellen werden bei 4 500 x g 10 min bei 20 °C zentrifugiert.
- Resuspendieren Sie das Pellet mit einer Suspensionslösung (10 mM MES, 10 mM MgCl2, pH 5,7) und stellen Sie OD600 auf 0,6 ein. 200 μM AS24 zugeben.
HINWEIS: Die Suspensionslösung bei 28 °C vorinkubieren. Wenn die Suspensionslösung bei der Zugabe kalt ist, fallen die Zellen aus. - Lassen Sie die Bakteriensuspension 2-24 h bei Dunkelheit und 25 °C stehen. Rühren ist nicht erforderlich22.
2. Pflanzenauswahl
- Wählen Sie eine Pflanze mit einem Zweig mit Blättern im optimalen Stadium für die Agroinfiltration.
HINWEIS: Die Pflanze kann ausgewachsen oder ein ausgewachsener Baum sein. Für Kakao werden junge Blätter des C-Stadiums empfohlen. Diese Blätter sind bronze- bis hellgrün gefärbt; sie sind weder vollständig ausgedehnt noch so starr wie die Blätter des StadiumsD 25 (Abbildung 1).- Führen Sie als Kontrolle gleichzeitig eine Agroinfiltration an anderen Pflanzen (z. B. Nicotiana tabacum) mit einer hohen Agroinfiltrationseffizienz durch, die für den verwendeten Stamm und Vektor angegeben wird.
HINWEIS: Wenn bei dieser Kontrolle keine positiven Ergebnisse erzielt werden, ist es möglich, dass die negativen Ergebnisse auf die Dehnung oder den verwendeten Vektor zurückzuführen sind.
- Führen Sie als Kontrolle gleichzeitig eine Agroinfiltration an anderen Pflanzen (z. B. Nicotiana tabacum) mit einer hohen Agroinfiltrationseffizienz durch, die für den verwendeten Stamm und Vektor angegeben wird.
3. Aufbau der Vakuumkammer
- Verwenden Sie als Vakuumkammer einen Exsikkator mit einem Vakuummeter, um den Vakuumdruck im Inneren zu messen.
- 250 μM Jasmonsäure (JA)18,26 werden der Agrobacterium-Suspension aus Schritt 1.19 zugegeben.
- Übertragen Sie die Agrobacterium-Kultur in ein Weithalsbecherglas, um den ausgewählten Zweig und die Blätter einzutauchen. Stellen Sie dann das Becherglas mit der Agrobacterium-Kultur in den Exsikkator.
- Legen Sie den Zweig zwischen den Exsikkator und seinen Deckel. Achten Sie darauf, die gewünschten Blätter in die Agrobacterium-Kultur zu tauchen. Verwenden Sie als Nächstes einen Biegering, einen runden Ring mit einem Ausschnitt, durch den der Pflanzenzweig in den Exsikkator gelangen kann. Der Biegering fungiert auch als Abstandshalter zwischen der Unter- und Oberseite des Exsikkators.
- Stellen Sie sicher, dass die Dichtung strukturstabil genug ist, um nicht mit dem Deckel gequetscht zu werden, flexibel genug, um sich zu biegen und an den Umfang des Exsikkators anzupassen, und nicht aus einem porösen Material besteht.
HINWEIS: In dieser Studie wurde ein Litzendraht aus Metall verwendet, der aus mehreren kleineren Drähten besteht, die miteinander verdrillt sind und mit einem nicht porösen Kunststoffmaterial beschichtet sind, das einer Dichtung ähnelt (Abbildung 2). - Um den Ast auf dem Exsikkator zu befestigen, verwenden Sie Silikon-Abformmaterial. Stellen Sie sicher, dass das Material klebrig, nicht porös, chemisch inert für den Exsikkator und die Pflanze ist und sich leicht auftragen lässt, und füllen Sie kleine Lücken zwischen dem Abzweig, der Dichtung und dem Exsikkator.
- Sobald das Silikonabformmaterial polymerisiert ist (dies dauert ca. 1 min) und den Ast fixiert, schließen Sie den Exsikkator. Achten Sie darauf, keine Lücken zu lassen.
- Schließen Sie den Exsikkator an die Vakuumpumpe an (Abbildung 3).
4. Vakuum-Infiltration
- Starten Sie die Vakuumpumpe, bis sie -0,07 MPa erreicht.
- Sobald dieser Druck erreicht ist, schließen Sie das Druckventil und schalten Sie die Vakuumpumpe aus. Halten Sie diesen Druck 5 Minuten lang aufrecht.
- Öffnen Sie das Druckventil, um den Kammerdruck wiederherzustellen.
HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt. Stellen Sie den Kammerdruck allmählich und gleichmäßig wieder her. Es kann bis zu 3 Minuten dauern, bis der Exsikkator wieder vollständig unter Druck gesetzt ist. Eine längere Druckentlastung erhöht die Anzahl der in das Gewebe eingedrungenen Bakterien10. - Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal.
- Nehmen Sie den Zweig von der Zellsuspension und dem Exsikkator.
- Reinigen Sie die infiltrierten Blätter mit destilliertem Wasser.
5. Inkubation von infiltrierten Blättern
- Lassen Sie die infiltrierten Blätter 48 h bei 25 °C dunkel stehen.
- Setzen Sie dann das infiltrierte Gewebe einer 16/8-stündigen Hell-/Dunkel-Photoperiode aus.
- Bewerten Sie die vorübergehende Blatttransformation 3-7 Tage nach der Infektion (DPI).
Abbildung 1: Kakaoblätter Entwicklungsstadien. (A-E) Entwicklungsstadien25. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Vakuumkammerkonfiguration und ihre Komponenten. Die Vakuumkammer ist ein Exsikkator, der mit einem Vakuummeter verbunden ist. Die Dichtung / der O-Ring ist so geschnitten, dass sie eine Öffnung hat, in der der Abzweig platziert wird. (A) Vakuummeter, (B) Deckel, (C) Dichtung / O-Ring, (D) Druckventil, (E) Exsikkator, (F) Schlauch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Im planta Vakuum-Agroinfiltrationssystem. Um Vakuumverluste während des Infiltrationsprozesses zu vermeiden, ist es wichtig, den Abzweig am Exsikkator und die Dichtung/den O-Ring mit Silikon-Abformmaterial zu befestigen. (A) Kakaopflanze, (B) Vakuumkammer, (C) Silikonabformmaterial, (D) Blätter auf Agrobacterium-Suspension getaucht, (E) Vakuumpumpe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Representative Results
Dieses Protokoll stellt eine effektive Agroinfiltrationsmethode für große Gehölze dar. Mit diesem Protokoll konnten wir einen Vakuumdruck von -0,07 MPa erreichen, was zu einer effektiven, lokalisierten Infiltration von Kakaoblättern führte. In Abbildung 4 sehen wir den Einrichtungsprozess des Infiltrationssystems und in Abbildung 5 die endgültige Konfiguration.
Abbildung 4: Aufbau der Vakuumkammer. (A) Beachten Sie die Abzweigplatzierung zwischen den beiden Enden der Dichtung. Diese Dichtung ist groß genug, damit der Abzweig zwischen dem Exsikkator und seinem Deckel hindurchpasst. Beachten Sie, dass sich aufgrund der unregelmäßigen Oberfläche des Astes Lücken bilden. (B) Der Ast wird auf dem Exsikkator befestigt und die gebildeten Lücken werden mit dem Silikonabformmaterial gefüllt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Aufbau des Vakuuminfiltrationssystems. Beispiel für den Aufbau des Vakuuminfiltrationssystems für eine große Kakaoanlage unter Verwendung des vorgeschlagenen Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
In der ersten Phase der Agroinfiltration wird das Gewebe einem reduzierten Druck ausgesetzt, wodurch Gase aus den Stomatahöhlen und den angrenzenden mesophyllen Lufträumen durch die Spaltöffnungen und durch die Wunden freigesetzt werden. Kleine Blasen auf der Oberfläche der Blätter, die in die Agrobacterium-Suspension getaucht sind, sind mit bloßem Auge zu sehen, wenn das Vakuum zunimmt. Der nächste Schritt besteht darin, das Gewebe wieder unter Druck zu setzen und die Agrobacterium-Suspension in das Innere zu zwingen, um den von der Luft hinterlassenen Hohlraum zu füllen11. Infiltrierte Blätter erscheinen in einigen Bereichen dunkler (Abbildung 6). Dies deutet darauf hin, dass die Agrobacterium-Suspension in das Gewebe eingedrungen ist und sich überall ausgebreitet hat und die Interzellularräume des Blattes8 ausfüllt.
Abbildung 6: Abaxiale Ansicht von erwachsenen Kakaoblättern nach Abschluss der Vakuum-Agroinfiltration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Dieses Protokoll erreichte eine Agroinfiltration auf lokalisierten Blättern großer Kakaopflanzen. Auf diese Weise transformierten wir vorübergehend große Kakaopflanzen mit einem Vektor, der 35S:RUBY als Reportersystem trägt. Wir fanden dieses Reportersystem als nützlichen Indikator für eine erfolgreiche vorübergehende Umwandlung in Kakao, da die Anreicherung von Betalainen in den Blättern die Effizienz der Umwandlung anzeigt. Betalaine sind leuchtend rote Pigmente, die auf den grünen Blättern ein unverwechselbares Signal erzeugen, das mit bloßem Auge beobachtet werden kann (Abbildung 7). Da die Blätter an der Pflanze haften, können sich Betalaine ansammeln, wenn das infiltrierte Gewebe seine Lebensfähigkeit beibehält. Abbildung 8 zeigt eine Reihe von Ergebnissen, die von einer hohen bis zu einer niedrigen Betalainakkumulation auf transformierten Kakaoblättern des Stadiums C reichen. Es ist erwähnenswert, dass dies die erste vorübergehende Transformation in planta ist, die über diese Art berichtet wurde.
Abbildung 7: Kakaoblätter, die vorübergehend in eine Überexpression von 35S umgewandelt wurden: RUBY. Rote Flecken auf Kakaoblättern, die aus der Betalain-Akkumulation resultieren, sind eine einfache und schnelle Möglichkeit, das vorgeschlagene Protokoll der lokalisierten vakuumbasierten Agroinfiltration in planta zu bewerten. Bild bei 6 DPI, Maßstab: 1 cm, optischer Zoom: 8x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Betalain-Akkumulation auf Kakaoblättern. Unterschiedliche Niveaus und Muster der Betalain-Akkumulation auf Kakaoblättern bei 6 DPI durch Agrobacterium-vermittelte transiente Transformation mit dem RUBY-Reporter. Maßstab: 1 cm, Optischer Zoom: 8x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| LB Mittel | YM Mittel | |
| Hefeextrakt | 5 g/L | 0,4 g/l |
| Trypton-Enzymverdau aus Kasein | 10 g/L | |
| NaCl | 5 g/L | 0,1 g/l |
| Mannit | 10 g/L | |
| MgSO4·7h20 | 0,204 g/L | |
| K2HPO4 | 0,38 g/L | |
| MES | 1,95 g/L (10 mM) | 1,95 g/L (10 mM) |
| MgCl2 |
Tabelle 1: Zusammensetzung von YM- und LB-Medien.
Ergänzende Abbildung 1: Repräsentatives Bild der erzwungenen Agroinfiltration auf Kakaoblättern mit einer nadellosen Spritze. Die Infiltration der Spritze führte nicht zu einer RUBY-Expression in den mit bloßem Auge sichtbaren Blättern, führte jedoch zu einer Schädigung an der Stelle, an der mit der nadellosen Spritze Druck ausgeübt wurde. Bild bei 6 DPI, Maßstabsleiste: 5 mm, optischer Zoom: 25x. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In dieser Arbeit haben wir ein effizientes, kostengünstiges Agroinfiltrationsprotokoll für die transiente Transformation von Gehölzen in planta am Beispiel von Kakaopflanzen vorgestellt. Angesichts der bekannten Einschränkung, die die Kutikula von Blättern für die Transformation von Pflanzengewebe darstellt, konzentrierten wir uns auf die Entwicklung einer Strategie zur Erleichterung der Agroinfiltration durch Vakuum bei Gehölzen, die diesem Verfahren normalerweise widerspenstig gegenüberstehen.
Der erreichte Vakuumdruck in der Vakuumkammer war nur durch das effiziente Abdichten und Füllen der kleinen Lücken möglich, die zwischen dem Exsikkator, dem Ast, der Dichtung/dem O-Ring und dem Deckel des Exsikkators entstanden sind, was die größte Herausforderung des Protokolls darstellte. Aus diesem Grund ist es wichtig, Silikonabformmaterial zu verwenden, um den Ast auf dem Exsikkator zu befestigen. Dieses Material ist porenfrei, erweist sich als klebrig genug, um den Ast am Exsikkator und an der Dichtung zu haften, und ist chemisch inert, sodass weder der infiltrierte Ast noch der Exsikkator beschädigt werden.
Darüber hinaus ist es notwendig, eine Vakuumpumpe zu verwenden, um einen Druckgradienten innerhalb des Blattabschnitts zu erreichen, wodurch Luft aus der Stomatahöhle und den Mesophyllregionen abgesaugt wird, dann drückt ein großer Druckgradient während der Druckbeaufschlagung die Agrobacterium-Suspension durch Stomata und Wunden in das Blatt10. Wir haben einen Gefriertrockner als Vakuumpumpe verwendet. Dies ist ein Beispiel für die Vielseitigkeit und Anpassungsfähigkeit dieses Protokolls an die Bedürfnisse jedes Labors. Mit dem Gefriertrockner als Vakuumpumpe dauerte es etwa 3 Minuten, um -0,07 MPa zu erreichen. Dies ist für Kakao wirksam, da frühere Autoren auch abgelöste Kakaoblätter mit dem gleichen Vakuumdruck vakuuminfiltriert haben25. Dies ist die bevorzugte Infiltrationsmethode, da sie wiederholbarer ist als die Infiltration von Spritzen ohne Unterstützung oder ohne Nadel (Ergänzende Abbildung 1). Bei Verwendung einer Vakuumpumpe für die Vakuuminfiltration kann der Benutzer den Druck und die Zeit steuern, in der das Gewebe dem Vakuum ausgesetzt ist10.
Bei anderen Pflanzen, wie Pappeln, wurde untersucht, dass die Blattstruktur aufgrund der Anordnung der Mesophyllzellen die Infiltrationseffizienz beeinflussen kann. Die unterschiedliche und variable Anordnung dieser Zellen kann zu einer ungleichmäßigen Infiltration durch die Agrobacterium-Suspension 8,27 führen, da die innere Struktur des Blattes interzelluläre Luftspalteaufweist 8. Obwohl beim Eintauchen der Blätter in eine Agrobacterium-Suspension eine spontane Infiltration durch die Spaltöffnungen der Blätter auftreten kann, ist der atmosphärische Druck nicht wirksam genug, um die epidermale Kutikula zu überwinden und diese Lufträume mit der Bakteriensuspension zu verdrängen. dies wurde mit anderen widerspenstigen Arten wie Persea americana18 versucht. Aus diesem Grund erweist sich die erzwungene vakuumvermittelte Agroinfiltration als effiziente Methode, um das Eindringen von Substanzen in die Blätter durch die Spaltöffnungen oder Wunden zu erleichtern10. Kürzlich wurde über die Inokulation junger Kakaosämlinge mit dem Badnavirus-Kakao-geschwollenen Trieb Ghana M-Virus infektiöser Klon durch biolistische Inokulation und Agroinokulation berichtet28. In Kakao werden die meisten transienten Transformationsassays an abgelösten Blättern durchgeführt25,29, was zu einer verringerten Aufrechterhaltung der transienten Expression aufgrund des Pflanzenmaterialabbaus führt. Unseres Wissens gibt es keine Berichte über eine vorübergehende genetische Transformation von Kakaopflanzen in planta. Hier haben wir die erste transiente Umwandlung von Kakao erreicht, und zuvor hat dieselbe Studiengruppe dies in Persea americana18 erreicht, was dies zu einer praktikablen Methode für eine mögliche lokalisierte In-vivo-Analyse von Metaboliten oder Molekülen macht, die nur auf Blättern exprimiert werden.
Die transiente Transformation mit dem 35S:RUBY-Vektor wurde durch die transiente Expression von Betalainen auf den Kakaoblättern bestätigt. Dieser Vektor stellt den Betalain-Biosyntheseweg bei Pflanzen wieder her, die diese Pigmente nicht auf natürliche Weise produzieren. Nur einige Caryophyllales können Betalaine aus Tyrosin mit ihren eigenen Stoffwechselwegen auf natürliche Weise biosynthetisieren30. Um diesen Stoffwechsel zu replizieren, enthält 35S:RUBY die genetische Information für die heterologe Expression von drei Enzymen, die die häufig vorkommende Aminosäure Tyrosin in Betalaine umwandeln7.
In planta haben transiente Transformationsprotokolle viele Vorteile gegenüber stabilen Transformationsprotokollen, einschließlich schnellerer, kostengünstiger und verbesserter Transformationseffizienz31. Darüber hinaus kann die transiente Transformation in planta für viele funktionelle Genomanalysen angewendet werden32. Funktionelle Genomikstudien an Kakao zielen darauf ab, die Krankheitsanfälligkeit dieser Art für viele Krankheitserreger wie Moniliophthora perniciosa und Phytophthora spp. 33 zu lösen, ihre Trockenresistenzzu erhöhen 34 und ihre organoleptischen Eigenschaftenzu verbessern 35. Dieses Protokoll hat das Potenzial, die funktionelle Genomik von Kakao zu verbessern und zu vertiefen, da es eine vorübergehende Transformation in planta an großen Kakaobäumen oder sogar an anderen großen, widerspenstigen und mehrjährigen Pflanzenarten ermöglicht.
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Disclosures
Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu deklarieren.
Acknowledgments
Wir danken Lic. Jesús Fuentes González und Néstor Iván Robles Olivares für ihre Unterstützung beim Filmen des Videomaterials. Wir danken Dr. Antonia Gutierrez Mora von CIATEJ (Theobroma-Kakaopflanzen ). Wir danken auch CIATEJ und Laboratorio Nacional PlanTECC, Mexiko, für die Unterstützung der Einrichtung. H.E.H.D. (CVU: 1135375) führte Masterstudien mit finanzieller Unterstützung des Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México (CONAHCYT) durch. R.U.L. dankt der Unterstützung des Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL) und der Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Jalisco, Mexiko (Grant 7270-2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S:RUBY plasmid | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
| 1 mm electroporation cuvette | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus |
| Desiccator | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | For YM medium add 0.38 g/L |
| LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | For YM medium add 10 g/L |
| MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM) |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM) |
| MgSO4·7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | For YM medium add 0.204 g/L |
| MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| President Silicone Impression material | COLTENE | 60019938 | |
| Rifampicin | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg/mL) |
| Silicone Impression material gun | Andent | TBT06 | |
| Spectinomycin | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
| Streptomycin | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
| Tryptone enzymatic digest from casein | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | For LB medium add 10 g/L |
| Yeast extract | MCD LAB | 9031 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L |
References
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