Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

بناء شبكات التمثيل الغذائي خارج التوازن في حويصلات بحجم النانو والميكرومتر

Published: April 12, 2024 doi: 10.3791/66627
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Groningen

Summary

نقدم بروتوكولا لإعادة تكوين بروتينات الغشاء وتغليف الإنزيمات والمكونات الأخرى القابلة للذوبان في الماء في حويصلات دهنية بحجم دون ميكرومتر وميكرومتر.

Abstract

نقدم طريقة لدمج شبكات البروتين المعقدة في الحويصلات ، والتي تتضمن بروتينات غشائية متكاملة ، وإنزيمات ، وأجهزة استشعار قائمة على التألق ، باستخدام مكونات منقاة. هذه الطريقة مناسبة لتصميم وبناء المفاعلات الحيوية ودراسة شبكات التفاعل الأيضي المعقدة خارج التوازن. نبدأ بإعادة تكوين بروتينات غشائية (متعددة) إلى حويصلات كبيرة أحادية الصفيحة (LUVs) وفقا لبروتوكول تم تطويره مسبقا. ثم نقوم بتغليف خليط من الإنزيمات المنقاة والمستقلبات وأجهزة الاستشعار القائمة على التألق (البروتينات أو الأصباغ الفلورية) عن طريق التجميد والذوبان والبثق وإزالة المكونات غير المدمجة عن طريق الطرد المركزي و / أو كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. يتم قياس أداء الشبكات الأيضية في الوقت الفعلي من خلال مراقبة نسبة ATP / ADP أو تركيز المستقلب أو الأس الهيدروجيني الداخلي أو المعلمات الأخرى عن طريق قراءات مضان. يمكن تحويل حويصلاتنا الغشائية المحتوية على البروتين بقطر 100-400 نانومتر إلى حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة (GUVs) ، باستخدام الإجراءات الحالية ولكن المحسنة. يتيح هذا النهج إدراج المكونات القابلة للذوبان (الإنزيمات والمستقلبات وأجهزة الاستشعار) في حويصلات بحجم ميكرومتر ، وبالتالي زيادة حجم المفاعلات الحيوية بأوامر من حيث الحجم. يتم احتجاز الشبكة الأيضية التي تحتوي على GUVs في أجهزة الموائع الدقيقة لتحليلها بواسطة المجهر الضوئي.

Introduction

يركز مجال البيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى على بناء الخلايا (الحد الأدنى) 1,2 والمفاعلات الحيوية الأيضية للتكنولوجيا الحيوية 3,4 أو الأغراض الطبية الحيوية 5,6,7,8. يوفر بناء الخلايا الاصطناعية منصة فريدة تسمح للباحثين بدراسة البروتينات (الغشائية) في ظروف محددة جيدا تحاكي تلك الموجودة في البيئات الأصلية ، مما يتيح اكتشاف الخصائص الناشئة والوظائف الكيميائية الحيوية المخفية للبروتينات وشبكات التفاعل9. كخطوة وسيطة نحو خلية اصطناعية تعمل بشكل مستقل ، يتم تطوير وحدات تلتقط السمات الأساسية للخلايا الحية مثل الحفاظ على الطاقة الأيضية ، وتخليق البروتين والدهون ، والتوازن. هذه الوحدات لا تعزز فهمنا للحياة فحسب ، بل لها أيضا تطبيقات محتملة في مجالات الطب8 والتكنولوجيا الحيوية10.

تقع البروتينات عبر الغشاء في قلب أي شبكة أيضية تقريبا لأنها تنقل الجزيئات داخل الخلية أو خارجها ، وتشير ، وتستجيب لجودة البيئة ، وتلعب العديد من أدوار التخليق الحيوي. وبالتالي ، فإن هندسة الوحدات الأيضية في الخلايا الاصطناعية تتطلب في معظم الحالات إعادة تكوين بروتينات الغشاء المتكاملة و / أو المحيطية في طبقة ثنائية غشائية تتكون من دهون محددة وسلامة عالية (نفاذية منخفضة). يمثل التعامل مع هذه البروتينات الغشائية تحديا ويتطلب معرفة محددة ومهارات تجريبية.

تم تطوير عدة طرق لإعادة تكوين البروتينات الغشائية داخل حويصلات الفوسفوليبيد ، غالبا بهدف دراسة الوظيفة11،12 ، والتنظيم13 ، والخصائص الحركية14،15 ، والاعتماد على الدهون15،16 ، و / أو الاستقرار17 لبروتين معين. تتضمن هذه الطرق التخفيف السريع للبروتين القابل للذوبان في المنظفات في وسط مائي في وجود الدهون18 ، وإزالة المنظفات عن طريق احتضان البروتين القابل للذوبان في المنظفات مع حويصلات دهنية غير مستقرة المنظفات وامتصاص المنظف (المنظفات) على حبات البوليسترين19 ، أو إزالة المنظفات عن طريق غسيل الكلى أو كروماتوغرافيا استبعاد الحجم20. تم استخدام المذيبات العضوية لتشكيل حويصلات دهنية ، على سبيل المثال ، عن طريق تكوين الأطوار البينية بين الزيتوالماء 21 ، ولكن غالبية البروتينات الغشائية المتكاملة يتم تعطيلها عند تعرضها لهذه المذيبات.

في مختبرنا ، نقوم في الغالب بإعادة تكوين البروتينات الغشائية بطريقة امتصاص المنظفات لتشكيل حويصلات كبيرة أحادية الصفيحة (LUVs) 19. تسمح هذه الطريقة بإعادة التكوين المشترك لبروتينات غشائية متعددة وتغليف في تجويف الحويصلة للإنزيمات والمستقلبات والمجسات22,23. يمكن تحويل LUVs المحتوية على البروتين الغشائي إلى حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة (GUVs) مع / بدون تغليف المكونات القابلة للذوبان في الماء ، إما باستخدام التكوين الكهربائي24 أو التورم بمساعدة الهلام25 وظروف محددة للحفاظ على سلامة بروتينات الغشاء26.

تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإعادة تكوين شبكة التمثيل الغذائي خارج التوازن في LUVs التي تجدد ATP من خلال انهيار L-arginine إلى L-ornithine27. يقترن تكوين ATP بإنتاج الجلسرين -3 فوسفات (G3P) ، وهو لبنة بناء مهمة لتخليق الفوسفوليبيد22,28. يتكون المسار الأيضي من بروتينين غشائيين متكاملين ، أرجينين / أورنيثين (ArcD) ومضاد G3P / Pi (GlpT). بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى ثلاثة إنزيمات قابلة للذوبان (ArcA ، ArcB ، ArcC) لإعادة تدوير ATP ، ويستخدم GlpK لتحويل الجلسرين إلى جلسرين 3-فوسفات ، باستخدام ATP من انهيار L-arginine ، انظر الشكل 1 للحصول على نظرة عامة تخطيطية للمسار. يمثل هذا البروتوكول نقطة انطلاق جيدة للبناء المستقبلي لشبكات تفاعل أكثر تعقيدا - لتخليق الدهون أو البروتينات أو تقسيم الخلايا. يدعم التركيب الدهني للحويصلات نشاط مجموعة واسعة من البروتينات الغشائية المتكاملة وقد تم تحسينه لنقل جزيئات متنوعة داخل أو خارج الحويصلات27،29،30.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على مسار إنتاج الأدينوسين الثلاثي الفوسفات وتخليق وإفراز الجليسرول 3-فوسفات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

باختصار ، تضاف بروتينات الغشاء المنقى (القابلة للذوبان في دوديسيل β-د-مالتوسيد ، DDM) إلى حويصلات الدهون المشكلة مسبقا والتي تم زعزعة استقرارها باستخدام Triton X-100 ، مما يسمح بإدخال البروتينات في الغشاء. تتم إزالة جزيئات المنظفات لاحقا (ببطء) عن طريق إضافة حبات البوليسترين المنشط ، مما يؤدي إلى تكوين بروتيليبوزومات محكمة الغلق. يمكن بعد ذلك إضافة المكونات القابلة للذوبان إلى الحويصلات وتغليفها عبر دورات التجميد والذوبان ، والتي تحبس الجزيئات في عملية اندماج الغشاء. الحويصلات التي تم الحصول عليها غير متجانسة للغاية والعديد منها متعدد الصفائح. ثم يتم بثقها من خلال مرشح من البولي كربونات بحجم مسام 400 أو 200 أو 100 نانومتر ، مما ينتج عنه حويصلات ذات حجم أكثر اتساقا ؛ كلما كان حجم المسام أصغر ، كانت الحويصلات أكثر تجانسا وأحادية الصفيحة ولكن بسعر حجم داخلي أصغر. تتم إزالة البروتينات غير المدمجة والجزيئات الصغيرة من المحلول الخارجي عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. يمكن تحويل البروتيوLUVs إلى حويصلات بحجم ميكرومتر عن طريق التورم بمساعدة الهلام ، ثم يتم جمع هذه البروتيو GUVs واحتجازها في رقاقة الموائع الدقيقة للتوصيف المجهري والمعالجة. يوضح الشكل 2 نظرة عامة تخطيطية للبروتوكول الكامل.

Figure 2
الشكل 2: نظرة عامة على بروتوكول إعادة تكوين البروتينات الغشائية وتغليف الإنزيمات والمكونات القابلة للذوبان في الماء في الحويصلات الدهنية ذات الميكرومتر الفرعي (LUVs) وحجم الميكرومتر (GUVs). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تعمل بروتوكولات إعادة التكوين والتغليف بشكل جيد ويتم الاحتفاظ بوظائف البروتينات ، لكن البروتيوLUVs و proteoGUVs غير متجانسة في الحجم. تسمح مناهج الموائع الدقيقة31,32 بتكوين حويصلات بحجم ميكرومتر تكون أكثر تجانسا في الحجم ، لكن إعادة التكوين الوظيفي لبروتينات الغشاء غير ممكنة بشكل عام لأن المذيب المتبقي في الطبقة الثنائية يعطل البروتينات. يتراوح حجم البروتيوLUVs من 100 إلى 400 نانومتر ، وعند تركيزات منخفضة من الإنزيمات ، قد يؤدي التغليف إلى حويصلات ذات مسارات أيضية غير مكتملة (التأثيرات العشوائية ؛ انظر الشكل 3). تعد LUVs مثالية لبناء وحدات أيضية محددة ، كما هو موضح هنا لإنتاج ATP وكتل البناء مثل G3P. يمكن تغليف هذه البروتيوLUVs في GUVs وتعمل كمقصورات تشبه العضيات للحويصلات المضيفة.

Figure 3
الشكل 3: عدد الجزيئات لكل حويصلة قطرها 100 أو 200 أو 400 نانومتر. أ: عندما تكون البروتينات المغلفة (الإنزيمات، المجسات) في نطاق 1-10 ميكرومتر. (ب) تتم إعادة التكوين عند 1 إلى 1000 ، ومن 1 إلى 10000 ، ومن 1 إلى 10000 ، ومن 1 إلى 100000 بروتين غشائي لكل ليبيد (مول / مول). نفترض أن الجزيئات مغلفة بالتركيزات المشار إليها ومدمجة في الغشاء بنسب البروتين إلى الدهون هذه. بالنسبة لبعض الإنزيمات، رأينا أنها ترتبط بالأغشية، وهو ما قد يزيد من تركيزها الظاهري في الحويصلات. اختصار: LPR = نسبة البروتين الدهني الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الإعداد العام

  1. المواد الكيميائيه
    1. قم بإذابة الدهون (في شكل مسحوق) إلى 25 مجم / مل في CHCl3 لصنع الجسيمات الشحمية المشكلة مسبقا.
      ملاحظة: يفضل تحضير مخزون الدهون الطازج ، ولكن يمكن أيضا تخزين محاليل المخزون عند -20 درجة مئوية لبضعة أسابيع. العمل مع الدهون في شكل مسحوق أكثر دقة من استخدام الدهون القابلة للذوبان بالفعل في CHCl3. يجب التعامل مع CHCl3 باستخدام ماصات زجاجية و / أو محاقن وتخزينها في عبوات زجاجية لأن CHCl3 يذيب البلاستيك.
    2. قم بإذابة الجزيئات الصغيرة (النيوكليوتيدات ، الأحماض الأمينية ، مجسات التألق) لإجراء التغليف في 50 mM KPi (المخزن المؤقت A ، انظر الجدول 1) واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.00 ± 0.01. قم بإذابة MgCl2 في الماء منزوع الأيونات لتجنب تكوين رواسب فوسفات المغنيسيوم.
      ملاحظة: يمكن تخزين محاليل المخزون عند -20 درجة مئوية لبضعة أسابيع ، باستثناء DTT ، الذي يتم تحضيره طازجا في يوم التجربة.
    3. إذابة الأيونات (مثل فالينوميسين ، نيجيريسين) إما في DMSO أو EtOH بتركيز مخزون 100-500 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية لبضعة أسابيع ؛ تجنب التبخر.
      ملاحظة: DMSO ليست متقلبة وبالتالي يفضل على EtOH. استخدم الزجاج بدلا من القوارير البلاستيكية لتجنب التصاق الأيونات بسطح القنينات.
  2. المخازن المؤقته
    1. قم بإعداد مخازن مؤقتة جديدة في يوم التجربة (الجدول 1). لا تخزن لمدة تزيد عن 24 ساعة.
  3. تنقية البروتينات القابلة للذوبان
    1. Express ArcA و ArcB و ArcC (نستخدم متغيرا محددا يسمى ArcC1) و PercevalHR و GlpK كما هو موضح سابقا27،28،33. تأكد من إضافة 10٪ v / v glycerol إلى محلول تحلل الخلية ، مما يعزز استقرار البروتينات. تنقية البروتينات القابلة للذوبان كما هو موضح27،28،33 والإبلاغ عنها قريبا فيما بعد.
    2. قم بإذابة 10 مل من محلول الخلايا (~ 5 جم من الوزن الرطب) في حمام ماء مثلج. في غضون ذلك ، ضع راتنج 2 مل (1 CV) Ni2+ -Sepharose على عمود تدفق الجاذبية (سعة 20 مل) مع ماء منزوع الأيونات (12 CVs) و Buffer B (4 CVs) للغسيل. نقل المحللة المذابة إلى الجليد ؛ العمل على الجليد ، ما لم ينص على خلاف ذلك.
    3. أضف الإيميدازول إلى تركيز نهائي قدره 10 mM إلى المحللة المذابة ، ثم صب المحلول على عمود تدفق الجاذبية. احتضان لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية مع nutation لطيف.
    4. بعد 1 ساعة ، تخلص من التدفق واغسل الراتنج باستخدام Buffer C (20 CVs).
    5. تخلص من البروتين باستخدام Buffer D. استخدم 60٪ CV لخطوة الشطف الأولى ، متبوعة ب 4-6 خطوات من 40٪ CVs.
    6. أوجد تركيز البروتين وأضف Na-EDTA إلى تركيز نهائي قدره 5 mM.
    7. قم بتدوير البروتين المنقى في جهاز طرد مركزي منضدية مبرد (السرعة القصوى ، 10 دقائق ، 4 درجات مئوية). قم بالتنقية عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم باستخدام Buffer E. قم بتجميع كسور الشطف معا وتركيزها إلى ~ 10 مجم / مل باستخدام مرشح مركز بقطع 30 كيلو دالتون. تحضير القسامات ذات الحجم المناسب (~ 20 ميكرولتر) ، والتجميد السريع مع النيتروجين السائل ، وتخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
      ملاحظة: من المهم تركيز الإنزيمات إلى 50-100 ميكرومتر لتقليل الحجم اللازم للتغليف.
  4. تنقية البروتينات الغشائية
    1. Overexpress ArcD و GlpT كما هو موضح سابقا22،27،33. تأكد من إضافة 10٪ v / v glycerol إلى المخزن المؤقت لتحلل الخلية ؛ لتنقية ArcD ، قم بتضمين عامل اختزال 2 mM (على سبيل المثال ، DTT) في المخزن المؤقت. تنقية البروتينات الموسومة بالتقارب بواسطة كروماتوغرافيا Ni2+-Sepharose.
      1. قم بإذابة حصصة من حويصلات الغشاء الخام (10-20 مجم من البروتين الغشائي الكلي) في حمام ماء مثلج.
        ملاحظة: بمجرد إذابة الجليد ، اعمل دائما على الثلج ما لم ينص على خلاف ذلك. انظر الجدول 1 للاطلاع على المخازن المؤقتة المستخدمة في هذا القسم.
      2. أضف الحويصلات الغشائية إلى Buffer F (ArcD) أو Buffer G (GlpT) إلى حجم نهائي يبلغ 6 مل. احتضان العينة لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية مع التقطيع اللطيف.
      3. افصل بروتينات الغشاء القابلة للذوبان عن حطام الغشاء عن طريق الطرد المركزي الفائق (337000 × جم ، 30 دقيقة ، 4 درجات مئوية). في غضون ذلك ، ضع 0.25 مل (1 CV) من راتنج Ni2 + -Sepharose على عمود تدفق الجاذبية (سعة 10 مل) مع ماء منزوع الأيونات (40 CVs) و 20 CVs من Buffer H (ArcD) أو Buffer I (GlpT).
      4. صب البروتين القابل للذوبان على عمود تدفق الجاذبية وأضف الإيميدازول إلى تركيز نهائي قدره 10 مللي مول. احتضان لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية مع التقطيع اللطيف.
      5. بعد 1 ساعة ، تخلص من التدفق واغسل الراتنج ب 20 سيرة ذاتية من Buffer J (ArcD) أو Buffer K (GlpT).
      6. قم بإزالة بروتين الغشاء في 60٪ CV (1st) و 40٪ CV (2nd-6 th) مع Buffer L (ArcD) أو Buffer M (GlpT).
      7. حدد تركيز البروتين وتابع إلى القسم 2.2. لإعادة تكوين الغشاء.
        ملاحظة: لا يتم إجراء تنقية استبعاد الحجم بالضرورة للبروتينات الغشائية لأن إعادة تكوين الغشاء تنتج تنقية مماثلة. يمكن تنفيذ الخطوتين 1.4 و 2.2 في يوم واحد من العمل. ابدأ بتنقية البروتين (الخطوة 1.4) في الصباح واستمر في إعادة التكوين (الخطوة 2.2) في فترة ما بعد الظهر. تنتهي إعادة التكوين في اليوم التالي (انظر القسم 2.2 للحصول على التفاصيل). نقطة التوقف: يمكن تخزين ArcD و GlpT المنقى والقابل للذوبان في DDM عند -80 درجة مئويةللاستخدام لاحقا ، ولكن هذا لا ينطبق على جميع بروتينات الغشاء. تحضير الحصصات ذات الحجم المناسب (50-200 ميكرولتر) ، والتجميد السريع مع النيتروجين السائل ، وتخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا. تنشط هذه البروتينات لعدة أشهر عند تخزينها عند -80 درجة مئوية في وجود 10٪ v / v glycerol.
  5. تحضير β الكازين لأغراض التخميل
    1. أعد تعليق 100 مجم من β-كازين في 20 مل من الماء منزوع الأيونات وقم بالمعايرة باستخدام 1 M NaOH حتى يذوب β-كازين تماما. ثم أضف 1 M من حمض الأسيتيك لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 واملأ الحجم إلى 50 مل بالماء منزوع الأيونات. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر وقم بعمل حصص 500 ميكرولتر.
      ملاحظة يمكن تخزين β-كازين في -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر. يوصى بتصفية β-casein مرة أخرى قبل الاستخدام لتجنب مجاميع β-casein من انسداد رقاقة الموائع الدقيقة.

مخزن مؤقت تكوين
المخزن المؤقت أ 50 مللي متر KPi درجة الحموضة 7.0
المخزن المؤقت ب 50 مللي مول KPi ، 100 مللي مول KCl ، 10٪ v / v الجلسرين ، 10 مللي مول إيميدازول ، درجة الحموضة 7.5
العازلة ج 50 مللي مول KPi ، 100 مللي مول KCl ، 10٪ v / v الجلسرين ، 50 مللي مول إيميدازول ، درجة الحموضة 7.5
العازلة D 50 مللي مول KPi ، 100 مللي مول KCl ، 10٪ v / v جلسرين ، 500 مللي مول إيميدازول ، درجة حموضة 7.5
المخزن المؤقت E 50 مللي مول KPi ، 100 مللي مول KCl ، 10٪ v / v الجلسرين ، درجة الحموضة 7.0
العازلة F 50 مللي مول KPi ، 100 مللي مول KCl ، 0.5٪ وزن / وزن DDM ، 10٪ v / v الجلسرين ، 2 مللي مول β-ميركابتوإيثانول ، درجة الحموضة 7.5
العازلة G 50 مللي مول Tris-HCl ، 0.5٪ وزن / وزن DDM ، 20٪ v / v الجلسرين ، درجة الحموضة 8
العازلة H 50 مللي مول KPi ، 100 مللي مول KCl ، 0.02٪ وزن / وزن DDM ، 10٪ v / v جلسرين ، 2 مللي مول β-ميركابتوإيثانول ، 10 مللي مول إيميدازول ، درجة حموضة 7.5
المخزن المؤقت الأول 50 ملليمتر Tris-HCl ، 0.04٪ وزن / وزن DDM ، 20٪ v / v الجلسرين ، 10 مللي مول إيميدازول ، درجة الحموضة 8.0
العازلة J 50 مللي مول KPi ، 200 مللي مول KCl ، 0.02٪ وزن / وزن DDM ، 10٪ v / v جلسرين ، 2 مللي مول β-ميركابتوإيثانول ، 50 مللي مول إيميدازول ، درجة حموضة 7.5
العازلة K 50 ملليمتر Tris-HCl ، 0.04٪ وزن / v DDM ، 20٪ v / v الجلسرين ، 50 مللي مول إيميدازول ، درجة الحموضة 8
العازلة L 50 مللي مول KPi ، 200 مللي مول KCl ، 0.02٪ وزن / وزن DDM ، 10٪ v / v الجلسرين ، 2 مللي مول β-ميركابتوإيثانول ، 500 مللي مول إيميدازول ، درجة الحموضة 7.5
العازلة M 50 ملليمتر Tris-HCl ، 0.04٪ وزن / v DDM ، 20٪ v / v جلسرين ، 500 مللي مول إيميدازول ، درجة حموضة 8
المخزن المؤقت N 50 مللي مول KPi ، 58 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 2 مللي متر DTT ، درجة الحموضة 7.0
العازلة O 50 مللي مول KPi ، 0.5 مللي مول L- أورنيثين ، 10 مللي متر Na-ADP ، 10 مللي متر MgCl2 ، 2 مللي متر DTT ، درجة الحموضة 7.0
المخزن المؤقت P 50 mM KPi pH 7.0 ، 2 mM DTT ، x mM الجلوكوز (x متنوع ليتناسب مع الأسمولية للوسط الخارجي والداخلي)
العازلة Q 50 مللي متر KPi درجة الحموضة 7.0 ، 0.5 مللي متر السكروز ، 2 مللي متر DTT
العازلة R 50 مللي مول KPi درجة الحموضة 7.0 ، 2 مللي متر DTT ، 10 مللي متر L- أرجينين ، x mM الجلوكوز

الجدول 1: المخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول.

2. البروتيليبوزومات: إعادة تكوين بروتينات الغشاء المنقى إلى حويصلات دهنية مسبقة التشكيل

  1. اليوم 1
    1. إعداد الحويصلات الدهنية مسبقة التشكيل
      1. اختر تركيبة الدهون (على سبيل المثال ، الدهون الفوسفاتية الاصطناعية ، الدهون القطبية E. coli ) على أساس متطلبات بروتينات الغشاء.
        ملاحظة: مزيج من DOPE و DOPG و DOPC (25:25:50 mol٪) هو نقطة انطلاق جيدة ، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى ستيرول أو كارديوليبين لبعض البروتينات. بالنسبة لبروتينات غشاء بلازما الخميرة ، نقوم بتضمين دهون بالميتويل أوليويل بدلا من ديولويل30. يكفي خليط DOPE و DOPG و DOPC (25:25:50 mol٪) لإعادة تكوين ArcD و GlpT.
      2. امزج الدهون المرغوبة (القابلة للذوبان في CHCl3) وتبخرCHCl 3 في مبخر دوار حتى يتم تشكيل طبقة دهنية. اغسل الدهون بإضافة ثنائي إيثيل الأثير بحجم متساو مثل CHCl3. تتبخر ثنائي إيثيل الأثير والحصول على فيلم الدهون الجافة.
      3. أعد تعليق طبقة الدهون إلى 20 مجم / مل من إجمالي الدهون في الوسط المائي (المخزن المؤقت أ). ابدأ بنصف الحجم الكلي ورجه برفق ؛ ثم ، انقل الدهون بعناية إلى أنبوب نظيف أو زجاجة ذات حجم مناسب. أضف Buffer A الطازج إلى القارورة وكرر الإجراء لإذابة الدهون المتبقية ونقلها إلى وعاء جديد. أضف المخزن المؤقت A الإضافي للوصول إلى تركيز نهائي قدره 20 مجم / مل.
      4. Sonicate الدهون المعلقة باستخدام صوتي التحقيق. استخدم المعلمات التالية لطرف صوتي بقطر 6 مم: كثافة 4 ميكرومتر ، سعة 70٪ ، 5 ثوان ، 45 ثانية ، 16 دورة. اغمر الدهون في حمام ماء مثلج يحتوي على EtOH لتجنب ارتفاع درجة الحرارة عن طريق الصوتنة.
      5. قم بتجميد العينة الصوتية (حجم 40 مل في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل) في النيتروجين السائل ، وقم بإذابة العينة في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة. كرر مرة واحدة ؛ بعد ذلك ، قم بقسمة الجسيمات الشحمية بالأحجام المرغوبة (على سبيل المثال ، 1 مل أو 20 مجم من الدهون الكلية في أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 مل).
        نقطة التوقف: يمكن إيقاف الإجراء عند هذه النقطة. قم بتجميد كل قسمة مرة أخرى (الدورة الثالثة) وتخزينها في النيتروجين السائل لمدة تصل إلى بضعة أشهر. احرص على ثقب أغطية الأنبوب مرتين بإبرة لتجنب انفجار الأنبوب عند الغليان السريع للنيتروجين السائل.
  2. اليوم 2
    1. إعادة تكوين البروتينات الغشائية المنقاة إلى الجسيمات الشحمية مسبقة التشكيل
      1. قم بإذابة حصة واحدة من الجسيمات الشحمية (20 ملغ من الدهون الكلية) في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة. في غضون ذلك ، قم بإعداد الطارد عن طريق تطبيق مرشح من اختيارك (على سبيل المثال ، البولي كربونات ، قطر المسام 400 نانومتر) ؛ قبل موازنة الطارد مع المخزن المؤقت A ؛ وقم بتحميل الجسيمات الشحمية المذابة ("محلول حليبي") في الطارد وتمريرها 13x عبر الفلتر. جمع الجسيمات الشحمية المبثوقة (الآن حويصلات أحادية الصفيحة كبيرة ؛ "محلول معتم") في وعاء زجاجي أو بلاستيكي بحجم مناسب (على سبيل المثال ، 15 مل). خفف الجسيمات الشحمية إلى 4 ملغ / مل مع المخزن المؤقت A المكمل ب 2 مللي متر DTT.
      2. انقل 1 مل من 4 مجم / مل ليبوزومات إلى كوفيت شفاف سعة 1 مل. في مقياس الطيف الضوئي ، قم بقياس الكثافة البصرية الأولية عند 540 نانومتر. صب العينة المقاسة مرة أخرى وأضف 50 ميكرولتر من 10٪ v / v Triton X-100 إلى الجسيمات الشحمية.
        ملاحظة: حجم المعايرة 50 ميكرولتر من 10٪ Triton-X100 مناسب ل 20 ملغ من الدهون في حجم 5 مل. ستؤدي إضافة Triton X-100 إلى تخفيف الدهون بنسبة ~ 5٪. اضبط حجم المعايرة عند العمل بكميات مختلفة من الجسيمات الشحمية. للحصول على إشارات كثافة بصرية مستقرة ، قم بمعايرة الجسيمات الشحمية باستخدام Triton X-100 في درجة حرارة الغرفة.
      3. كرر الخطوة 2.2.1.2 ولاحظ عند الوصول إلى الحد الأقصى للكثافة البصرية (Rsat). استمر في المعايرة بالتحليل الحجمي حتى يتم الوصول إلى كثافة بصرية تبلغ حوالي 60٪ Rsat (الشكل 4). صب الحويصلات المزعزعة للاستقرار بالمنظفات مرة أخرى في الأنبوب الزجاجي / البلاستيكي (الحجم النهائي الآن حوالي 5.2 مل) ، وانقل العينة إلى الثلج ، واتركها تبرد.
      4. أضف بروتين (بروتينات) الغشاء المنقى إلى الجسيمات الشحمية غير المستقرة للوصول إلى نسبة الدهون إلى البروتين المطلوبة (وزن / وزن). استخدم نسبة 400: 1 لأسفل إلى 100: 1 وزن / وزن ؛ نظرا لأن كلا من ArcD و GlpT لهما أوزان جزيئية تبلغ ~ 55 كيلو دالتون ، فإن نسبة الدهون إلى البروتين البالغة 400: 1 وزن / وزن تتوافق مع ~ 30000 دهون لكل بروتين ، و ~ 50 جزيئا من ArcD و GlpT لكل حويصلة بقطر 400 نانومتر.
        ملاحظة: هنا نستخدم 400: 1 وزن / وزن ، أي ما يعادل 50 ميكروغرام من كل بروتين لكل 20 ملغ من الدهون.
      5. قم بتسخين العينات عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح لبروتينات الغشاء بالدخول في الغشاء الشحمي غير المستقر.
      6. لإزالة المنظف ، أضف 200 مجم من حبات البوليسترين الجافة ، المحضرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ينقع على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة إضافية.
        ملاحظة: كمية 200 ملغ من الخرز الجاف مناسبة ل 20 ملغ من الدهون ولكن يجب تعديلها عند استخدام حجم عينة مختلف.
      7. كرر الخطوة 2.2.1.6 2x ، ليصبح المجموع ثلاث إضافات من حبات البوليسترين. ثم احتضنها طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع التقطيع اللطيف.
  3. اليوم 3
    1. كرر الخطوة 2-2-1-6؛ ومع ذلك ، هذه المرة ، nutate عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. قم بتأمين عمود تدفق الجاذبية الفارغ (سعة 10 مل) فوق أنبوب طرد مركزي فائق فارغ سعة 6.5 مل على الجليد. صب العينة في العمود وجمع البروتينات في أنبوب الطرد المركزي الفائق (يتم الاحتفاظ بالخرز في العمود).
    3. اغسل الخرزات ب 0.5 مل من المخزن المؤقت A المكمل ب 2 mM DTT وجمع المرشح في أنبوب الطرد المركزي الفائق.
    4. تركيز البروتيليبوزومات عن طريق الطرد المركزي الفائق (337000 × جم ، 30 دقيقة ، 4 درجةمئوية). إعادة تعليق البروتيليبوزومات في حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر (100 ملغ من الدهون / مل) في المخزن المؤقت A المكمل ب 2 mM DTT ؛ الحجم الجاف للحويصلات بعد الطرد المركزي هو ~ 40 إلى 120 ميكرولتر27. تنقسم إلى حصص بالحجم المطلوب (على سبيل المثال ، ثلاث حصص من 6.66 ملغ من إجمالي الدهون).
      ملاحظة: حجم القسمة تعسفي ولكنه سيؤثر على حجم الحبيبات في خطوات لاحقة (انظر الخطوة 3.2.3.1). نقطة التوقف: يمكن إيقاف الإجراء هنا. قم بتجميد كل قسمة وتخزينها في النيتروجين السائل لمدة تصل إلى بضعة أسابيع. احرص على ثقب أغطية الأنبوب مرتين بإبرة لتجنب انفجار الأنبوب عند الغليان السريع للنيتروجين السائل.

Figure 4
الشكل 4: معايرة الجسيمات الشحمية مسبقة التكوين باستخدام Triton X-100. يتم بثق الجسيمات الشحمية عند 5 ملغ من الدهون / مل من خلال مرشح البولي كربونات (400 نانومتر) في 50 مللي مول KPi (درجة الحموضة 7.0) ثم معايرتها باستخدام Triton X-100 (خطوة البروتوكول 2.2.1.2). تقاس عكارة الحويصلات عند A540. يشير السهم إلى تركيز Triton X-100 الذي يتم فيه زعزعة استقرار الحويصلات بشكل كاف للإدخال التلقائي لبروتينات الغشاء كما هو موضح في19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تغليف شبكة التمثيل الغذائي لإعادة تدوير ATP وتوليف الجلسرين 3-P في حويصلات بحجم أقل من ميكرون

  1. اليوم 1
    1. خلط المكونات
      1. للحصول على تغليف قياسي ، استخدم 66.6 ميكرولتر من البروتيليبوزومات في حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر (33.33 مجم / مل من إجمالي الدهون). احسب حجم كل مكون (إنزيم ، عامل مساعد) مطلوب للوصول إلى التركيز المطلوب ، وأضف هذه المكونات إلى البروتيليبوزومات ، واضبط الحجم على 200 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت A (الجدول 2).
        ملاحظة: يمكن تعديل تركيز البروتين بناء على الإعداد التجريبي. ومع ذلك ، يجب الحرص على أن تكون عدة نسخ (>10) من كل إنزيم موجودة في المتوسط لكل حويصلة ، لتجنب التأثيرات العشوائية غير المرغوب فيها. التركيزات > 1 ميكرومتر آمنة بشكل عام ؛ 1 ميكرومتر في حويصلة بقطر 400 نانومتر يتوافق مع حوالي 20 نسخة (الشكل 3).
      2. المخزن المؤقت للماصة A في أنبوب فارغ سعة 1.5 مل وأضف DTT و Na-ADP و MgCl2 و L-ornithine (والبيرانين ، إذا لزم الأمر لقياسات الأس الهيدروجيني الداخلية). بعد ذلك ، أضف الإنزيمات واخلطها برفق. أضف المحلول فوق الجسيمات البروتينية المشكلة مسبقا ، ودوامة لفترة وجيزة بسرعة منخفضة.
        ملاحظة: من المهم إضافة Na-ADP قبل MgCl2 لتجنب التكوين غير المرغوب فيه لرواسب فوسفات المغنيسيوم. الدوامة مطلوبة للخلط السليم للمحلول اللزج ؛ ومع ذلك ، قلل المدة والسرعة لتجنب الأضرار الميكانيكية للبروتينات. لا يمكن تغليف PercevalHR والبيرانين بشكل مشترك لأن أطيافهما تتداخل.
    2. تحديد الأسمولية الداخلية
      1. قم بإعداد محلول 50 ميكرولتر كما هو موضح في الخطوة 3.1.1.1 ولكن بدون بروتيليبوزومات ، وقم بقياس الأسمولية باستخدام مقياس تناضح درجة التجمد.
      2. قم بإعداد منحنى معايرة باستخدام المخزن المؤقت (50 mM KPi pH 7.0) وتركيزات متفاوتة من الملح (على سبيل المثال ، NaCl أو NaCl) أو السكر. حدد تركيز الأسموليت الذي يطابق الأسمولية الداخلية (Buffer N).
        ملاحظة: لا يمكن استخدام المكونات المنفذة للغشاء (مثل الجلسرين) لمطابقة الأسمولية الداخلية. بالنسبة للبروتينات القابلة للذوبان في المخزن المؤقت المحتوي على الجلسرين (على سبيل المثال ، Buffer E) ، يجب استخدام نفس المخزن المؤقت بدون الجلسرين. يجب أن يكون الأسموليت المختار لإعداد المخزن المؤقت الخارجي متساوي التناضح غير منفذ للغشاء ولا يتداخل مع شبكة التمثيل الغذائي.
    3. تجميد ذوبان الجليد
      1. تجميد فلاش (في النيتروجين السائل) البروتينات مع المكونات القابلة للذوبان ، وذوبان الجليد في حمام الماء والجليد في حوالي 10 درجة مئوية.
      2. كرر الخطوة 3-1-3-1 ليصبح المجموع 5 أضعاف.
        نقطة التوقف: يمكن إيقاف الإجراء هنا. تخطي خطوة الذوبان الأخيرة ، وقم بتخزين العينة المجمدة في النيتروجين السائل لمدة 1-3 أيام. احرص على اختراق أغطية الأنبوب 2x بإبرة لتجنب انفجار الأنبوب عند الغليان السريع للنيتروجين السائل. يفضل التخزين في النيتروجين السائل على -80 درجة مئوية لتقليل أكسدة الدهون.
  2. اليوم 2
    1. النتوء
      ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات البثق في درجة حرارة الغرفة ، حيث ستتسرب المحاقن المانعة للغاز.
      1. قم بإعداد الطارد عن طريق تطبيق مرشح من اختيارك (على سبيل المثال ، البولي كربونات ، قطر المسام 400 نانومتر). اغسل الطارد بمحلول يحتوي على نفس المخزن المؤقت والمستقلبات المستخدمة في تغليف الحويصلات (على سبيل المثال ، Buffer O بالإضافة إلى 0.1 mM pyranine).
        ملاحظة: استخدم آلة بثق مخصصة لتحميل البروتيليبوزومات بالبيرانين حيث تلتصق الصبغة بسطح الطارد ويمكن أن تسبب تلوثا في العينات اللاحقة.
      2. قم بتحميل خليط التغليف في الطارد ، وقم بتمريره عبر المرشح 13x. اجمع المحلول المبثوق في أنبوب سعة 1.5 مل.
    2. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (اختياري)
      ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لإزالة الجزيئات الخارجية مثل الأصباغ مثل البيرانين عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. إذا لم تكن الأصباغ موجودة في النظام ، ولم تتداخل المكونات الأخرى بتركيزات منخفضة (لاحظ أن الحويصلات يتم غسلها بعد ذلك أيضا عن طريق الطرد المركزي الفائق) ، فعندئذ الخطوة 3.2.2. يمكن تخطيها.
      1. أعد ترطيب راتنج Sephadex G-75 واسكبه في عمود زجاجي (طوله 22 سم وعرضه 1.5 سم). قم بموازنة الراتنج مع وجود فائض من المخزن المؤقت الخارجي (على سبيل المثال ، Buffer N).
      2. قم بتحميل البروتيليبوزومات المبثوقة من الخطوة 3.2.1.2 على عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم المتوازن مسبقا وقم بتطبيق تدفق الجاذبية للمخزن المؤقت الخارجي. تجاهل حجم الفراغ (حوالي 7 مل) ؛ ثم اجمع عشرة قسامات سعة 1 مل. تصور القسمة المحتوية على البروتيليبوزوم عن طريق التعرض القصير لمصباح الأشعة فوق البنفسجية. اجمع الكسور التي تحتوي على معظم الجسيمات البروتينية (2-4 مل).
    3. الغسيل وإعادة التعليق
      1. اغسل البروتيليبوزومات المبثوقة عن طريق الطرد المركزي الفائق. املأ أنبوب طرد مركزي فائق سعة 6.5 مل ب 5.8 مل من Buffer N ، وقم بتطبيق العينة المبثوقة في الأعلى. إذا تم إجراء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، املأ الأنبوب بعينات الشطف المجمعة (2-4 مل) وأضف Buffer N إلى حجم نهائي قدره 6 مل.
      2. أجهزة طرد مركزي عند 337000 × جم ، 30 دقيقة ، 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، وجفف أنبوب الطرد المركزي الفائق تماما بمنديل خال من الغبار مع الانتباه إلى عدم لمس الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات في حجم صغير من Buffer N (200 ميكرولتر). عندما يتم إعادة الحبيبات بالكامل ، املأ الأنبوب حتى 6 مل باستخدام Buffer N.
        ملاحظة: سيستغرق تعليق الحبيبات وقتا ويجب أن يتم بعناية.
      3. كرر الخطوات 3-2-3-1-3-2-3-2 2x، لما مجموعه ثلاث غسلات، ما لم يتم إجراء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (وفي هذه الحالة تكفي خطوة طرد مركزي واحدة). في النهاية ، أعد تعليق الحبيبات إلى التركيز المطلوب (على سبيل المثال ، 5.55 مجم / مل من إجمالي الدهون) عن طريق إضافة حجم مناسب من Buffer N.
        نقطة التوقف: يمكن استخدام البروتيليبوزومات على الفور أو تخزينها عند 4 درجاتمئوية لمدة 48 ساعة على الأقل. يجب اختيار حجم أنابيب الطرد المركزي الفائقة بناء على حجم العينة. بالنسبة لحبيبات 6.66 مجم من إجمالي الدهون ، يكون الأنبوب 6.5 مل مناسبا. غسل 200 ميكرولتر من البروتيليبوزومات (33.33 مجم من الدهون / مل في المجموع ؛ حجم الحبيبات الجافة ~ 40 ميكرولتر) 28 ل 3 × 6 مل من المخزن المؤقت يخفف المكونات الخارجية بعامل 100 لكل خطوة غسيل. إذا تم استخدام أنابيب بأحجام مختلفة ، فمن المستحسن ضبط عدد الغسلات وفقا لذلك.
  3. اليوم 3
    1. الكشف عن تخليق ATP عن طريق مضان
      1. امزج مكونات التفاعل مع حجم نهائي يبلغ 120 ميكرولتر (الجدول 3) في كوفيت كوارتز أسود مع نافذة 3 × 5 مم وحجم داخلي لا يقل عن 100 ميكرولتر.
        ملاحظة: يمكن إضافة الأيونوفورات لتبديد تدرجات الأيونات الكهروكيميائية. مزيج من valinomycin و nigericin (1 μM لكل منهما) يبدد بشكل فعال أي تدرجات البروتون والبوتاسيوم.
      2. سخن العينة في مقياس فلورومتر مضبوط على 30 درجة مئوية واكتسب أطياف الإثارة ل PercevalHR (الإثارة 400-520 نانومتر ، عرض النطاق الترددي 5 نانومتر ؛ الانبعاث 550 نانومتر ، عرض النطاق الترددي 5 نانومتر). بمجرد أن تكون إشارة المسبار ثابتة ، ابدأ شبكة التمثيل الغذائي بإضافة فائض من L-arginine (5-10 mM) ، والجلسرين (400 μM) عندما تقترن إعادة تدوير ATP بتوليف الجلسرين 3-فوسفات. اتبع رد الفعل مع مرور الوقت.
    2. تحليل البيانات
      1. ارسم النسبة F500 / F430 كدالة للوقت ، وهو مؤشر نوعي لنسبة ATP / ADP. للحصول على تقييم كمي أكثر لتشكيل ATP ، قم ببناء منحنى معايرة في الجسيمات البروتينية أو استخدم نهجا تكميليا (على سبيل المثال ، القياس الكمي ATP بواسطة التلألؤ الكيميائي28).
مكون التركيز النهائي
المخزن المؤقت أ 50 مللي متر KPi درجة الحموضة 7.0
دي تي تي 2 مللي متر
نا-ADP 10 مللي متر
مغ سي سي ال2 10 مللي متر
إل-أورنيثين 0.5 مللي متر
مسبار الفلورسنت (PercevalHR أو بيرانين) 5.8 ميكرومتر أو 0.1 مللي متر ، على التوالي
ArcA (أرجينين ديميناز) 1 ميكرومتر
ArcB (أورنيثين كاربامويل ترانسفيراز) 2 ميكرومتر
ArcC1 (كاربامات كيناز) 5 ميكرومتر
GlpK (الجلسرين كيناز) 1.6 ميكرومتر
البروتيوليبوزومات 33.33 ملغم/مل مجموع الدهون

الجدول 2: مكونات التغليف. يتم سرد المكونات بترتيب الإضافة. البروتينات القابلة للذوبان في المخزن المؤقت E. جميع المكونات الأخرى (باستثناء MgCl2 ، في الماء منزوع الأيونات) موجودة في المخزن المؤقت A.

مكون التركيز النهائي
العازلة K 50 مللي مول KPi درجة الحموضة 7.0 ، 58 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 2 مللي متر DTT ، الرقم الهيدروجيني 7.0
البروتيليبوزومات (5.55 مجم / مل من الدهون) 2.7 ملغم/مل من الدهون
الأيونوفورات (فالينوميسين ، نيجيريسين) 1 ميكرومتر لكل منهما

الجدول 3: الظروف التجريبية. يتم سرد المكونات بترتيب الإضافة. توجد البروتياليبوزومات في Buffer N ، والأيونوفورات في DMSO أو EtOH.

4. رفع مستوى شبكة التمثيل الغذائي للحويصلات بحجم ميكرومتر

  1. اليوم 1
    1. إعداد رقاقة الموائع الدقيقة
      ملاحظة: تستخدم هذه التجربة جهاز الموائع الدقيقة الذي طوره Robinson et al.34. تتوفر تصميمات أخرى لرقائق الموائع الدقيقة35،36،37 ويمكن تنفيذها بسهولة في هذا البروتوكول.
      1. اقطع طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر بمقدار ثلث الأسفل وأدخل الجزء السفلي من الطرف في جهاز محاصرة الموائع الدقيقة الجاهز.
      2. إلى خزان مدخل الرقاقة ، أضف 400 ميكرولتر من محلول β-كازين (2 مجم / مل ؛ انظر الخطوة 1.5) ، مع الحرص على منع دخول الهواء في هذه الخطوة. ضع دلوا من 96 بئرا وأضف أنسجة مختبرية في جهاز طرد مركزي مخروطي منضدية. ضع الشريحة فوق الأنسجة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق عند 900 × جم للسماح بتخميل شريحة الموائع الدقيقة. بعد خطوة الطرد المركزي ، يجب أن يكون مستوى السائل متساويا في خزان المدخل وطرف مخرج رقاقة الموائع الدقيقة ؛ تحقق من تسرب الشريحة. احتضان محلول β الكازين في رقاقة الموائع الدقيقة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
      3. قم بإزالة معظم محلول التخميل دون إدخال الهواء وأضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل (المخزن المؤقت P). ضع الشريحة على دلو لوحة 96 بئرا وأجهزة الطرد المركزي على 900 × جم لمدة 6 دقائق. اترك الشريحة في محلول الغسيل حتى الاستخدام (بحد أقصى 4 ساعات).
  2. إعداد هلام لصنع البروتينات GUVs
    ملاحظة: الوصف التالي مأخوذ ومقتبس من25،38.
    1. إذابة 0.5٪ (وزن / وزن) من أغاروز درجة حرارة التبلور المنخفضة (LGT) في الماء منزوع الأيونات عن طريق تسخين المحلول في الميكروويف ؛ تأكد من إذابة الأغاروز تماما وتجنب غليان المحلول. احفظ الأغاروز عند 50 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
      ملاحظة: يمكن تخزين الأغاروز المذاب في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع. لإعادة استخدام الأغاروز ، ما عليك سوى إذابة الجل باستخدام الميكروويف.
    2. خذ شريحتين موضوعيتين وارسم مخطط الفاصل على الشرائح. جعل الشرائح ماء عن طريق تنظيف البلازما ، وذلك باستخدام البلازما عالية الأكسجين لمدة 1 دقيقة.
    3. أضف أغاروز LGT أعلى الشريحة حتى يتم تغطيتها بالكامل بالأغاروز (~ 500 ميكرولتر) ؛ ثم قم بإمالة الشريحة بزاوية 90 درجة واستنزاف الأغاروز الزائد على منديل. اترك الشرائح لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية.
    4. خذ البروتيليبوزومات المخزنة في النيتروجين السائل (القسم 3) وذوبان الجليد. خفف الحويصلات إلى 5 ملغم / مل من الدهون باستخدام المخزن المؤقت Q.
      ملاحظة: لا تحتوي البروتياليبوزومات المحضرة في القسم 3 على بروتينات قابلة للذوبان ويمكن تحضيرها مسبقا إذا تم تخزينها في النيتروجين السائل. عند العمل مع proteoGUVs ، تأكد دائما من تصفية حلول العمل لمنع انسداد جهاز الموائع الدقيقة.
    5. قم بتنشيط الجسيمات الشحمية البروتينية باستخدام صوتنة مسبار محمول باليد مع مسبار 1 مم. Sonicate لمدة 10 دورات من 0.5 ثانية على و 0.5 ثانية قبالة بسعة 70٪. احتفظ بالحويصلات ، المشار إليها فيما يلي باسم proteoSUVs ، على الجليد لمدة 30 ثانية ، وكرر عملية الصوتنة 5x.
    6. املأ حقنة سعة 100 ميكرولتر (في موزع LCP محمول باليد) بنظام التعليق البروتيني SUV. إيداع 0.5 ميكرولتر من قطرات البروتيو SUV على هلام الأغاروز المعد مسبقا ؛ احرص على عدم إزعاج طبقة الأغاروز والحفاظ على مسافة كافية لمنع القطرات من الانصهار.
      ملاحظة يسمح استخدام موزع LCP المحمول باليد بترسيب القطرات بطريقة قابلة للتكرار ، ولكن يمكن أيضا استخدام أنظمة سحب بديلة للسحب. الإكتشاف باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية أقل ملاءمة لأنه يزعج هلام الأغاروز المجفف.
    7. جفف قطرات سيارات الدفع الرباعي في ~ 10 دقائق باستخدام تدفق النيتروجين بدلا من الهواء المضغوط لتقليل إمكانية أكسدة الدهون.
    8. تحضير 1 مل من المخزن المؤقت المركز 1.25x O (الجدول 4) في المخزن المؤقت A والمرور عبر مرشح خلات السليلوز 0.2 ميكرومتر. خذ 800 ميكرولتر من المحلول المركز 1.25x وأضف الإنزيمات والمجسات القابلة للذوبان إلى تركيز كما هو موضح في الجدول 4. استخدم الماء منزوع الأيونات المصفى لجعل الحجم النهائي 1 مل.
    9. تحضير 100 ميكرولتر من محلول التورم الذي يحتوي على جميع مكونات الجدول 4 ، باستثناء البروتينات والجلسرين. قم بقياس أسمولية محلول التورم باستخدام مقياس تناضح نقطة التجمد المعاير المكون من 3 نقاط.
      ملاحظة: تحضير 100 ميكرولتر من محلول التورم بدون بروتين وجلسرين لتحديد أسمولية هذا المحلول بدقة. يؤثر الجلسرين ، الموجود في محلول البروتين ، على الأسمولية ، ولكن في GUVs ، ينتشر الجلسرين بسرعة عبر الغشاء ويؤدي فقط إلى اختلافات تناضحية عابرة.
    10. قم بتجميع غرفة التورم GUV عن طريق صنع شطيرة من كأسين موضوعيين يحتويان على الجل وسيارات الدفع الرباعي المجففة مع فاصل تفلون بسمك 1.5 أو 3.0 مم بينهما. ثم أضف محلول التورم في الحجرة من خلال الفتحة الصغيرة في الجانب باستخدام حقنة وإبرة.
      ملاحظة: يمكن ضبط حجم محلول التورم عن طريق تغيير الفواصل من 1.5 إلى 3.0 مم.
  3. تورم الحويصلات وحصاد GUVs
    1. السماح بتورم الحويصلات عن طريق وضع الحجرة على حرارة 22 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: يمكن أن يتبع تورم الحويصلات المجهر الضوئي ، (على سبيل المثال ، مجهر تباين طور الطاولة أو مجهر مضان واسع المجال) إذا تم تمييز البروتينات أو الدهون بالفلورسنت.
    2. حصاد GUVs من الجل عن طريق تطبيق التحريض البدني اللطيف عن طريق النقر على الغرفة على سطح صلب (على سبيل المثال ، مقعد المختبر) ؛ أخرج ثلث الحجم واستخدم فقاعة الهواء الناتجة لتحفيز الحركة بلطف على السائل المتبقي وبالتالي فصل GUVs عن الجل.
    3. أثناء تورم GUVs ، قم بإعداد المخزن المؤقت P ومطابقة الأسمولية مع محلول التورم عن طريق ضبط تركيز الجلوكوز. قم بتصفية المخزن المؤقت من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر.
      ملاحظة: بشكل عام ، يجب حفظ محلول الغسيل والركيزة في حدود ± 5 موسمول / كجم. يجب أن يكون أي محلول يمر عبر الشريحة نظيفا جدا لأن الملوثات قد تسد القنوات. اصنع مخازن مؤقتة جديدة في كل مرة أو قم بتخزين المخازن المؤقتة المحضرة عند -20 درجة مئوية وقم بالتصفية قبل الاستخدام.
  4. محاصرة GUVs لتجارب الفحص المجهري
    1. قم بتركيب رقاقة الموائع الدقيقة المخملة على مرحلة عينة المجهر. تحقق من وجود عيوب محتملة (مثل التسريبات والهواء المحبوس والقنوات المسدودة).
      ملاحظة: يمكن فحص الشريحة جيدا قبل استخدامها بحيث يمكن تحضير شريحة جديدة إذا لزم الأمر.
    2. قم بتوصيل الأنبوب باستخدام إبرة مثنية بمخرج الخزان وقم بتوصيل الطرف الآخر بحقنة سعة 1 مل. قم بتركيب المحقنة على مضخة واضبط معدل التدفق على 10 ميكرولتر / دقيقة كحد أقصى.
    3. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل من الخزان (الخطوة 4.1.1.3) واستبدله بوسط جديد (المخزن المؤقت P). ابدأ تدفق المخزن المؤقت عبر الشريحة عن طريق التسريب عبر المحقنة بمعدل 1-10 ميكرولتر / دقيقة. اغسل بما لا يقل عن 80 ميكرولتر من محلول الغسيل المتوازن تناضحيا (Buffer P).
    4. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل الزائد من الخزان وأضف (البروتين) GUVs إلى الخزان. اضبط معدل التدفق على 0.1-1 ميكرولتر / دقيقة للسماح ل GUVs بالتدفق عبر الشريحة. راقب الشريحة بمرور الوقت حتى يتم احتجاز عدد كاف من GUVs في الشريحة.
      ملاحظة: يتم إدخال الحويصلات التي تحتوي على كميات كبيرة نسبيا (>20 مول٪) من الدهون المشحونة مثل فوسفاتيديل جليسرول (PG) أو فوسفاتيديل سيرين (PS) أو حمض الفوسفاتيديك (PA) أو الدهون غير ثنائية الطبقة مثل فوسفاتيديل إيثانولامين (PE) بمعدل تدفق أقل عبر الرقاقة لمنع الانفجار. الحويصلات المكونة من فوسفاتيديل كولين النقي (PC) تميل إلى أن تكون أكثر استقرارا.
    5. قم بإزالة محلول GUV الزائد وإضافة المخزن المؤقت للغسيل P ، باستخدام تدفق مستمر من 0.1-1 ميكرولتر / دقيقة ، لتبادل الوسط الخارجي وغسل GUVs المحاصرة لمدة ساعة واحدة على الأقل لإزالة المركبات غير المغلفة وخفض مضان الخلفية عند تغليف الفلوروفور. مراقبة مضان الخلفية بمرور الوقت ؛ إذا لم ينخفض مضان الخلفية ، فقد يتم حظر الشريحة.
    6. توطين الفخاخ بكميات كافية من الحويصلات وحفظ مواقعها. قم بتطبيق الإعدادات على المجهر (على سبيل المثال ، شدة الليزر ، والكسب ، والطول الموجي) وابدأ تجربة سلسلة زمنية.
    7. أضف محلول الركيزة المتوازن تناضحيا (المخزن المؤقت R) إلى الخزان وابدأ معدل تدفق 0.5 ميكرولتر / دقيقة.

مكونات المخزن المؤقت L
مكون 1.25 × تركيز تركيز العمل
المخزن المؤقت أ 62.5 مللي متر KPi درجة الحموضة 7.0 50 مللي متر KPi درجة الحموضة 7.0
سكروز 125 مللي متر 100 مللي متر
دي تي تي 2.5 مللي متر 2 مللي متر
نا-ADP 12.5 مللي متر 10 مللي متر
مغ سي سي ال2 12.5 مللي متر 10 مللي متر
إل-أورنيثين 0.625 مللي متر 0.5 مللي متر
مكونات التغليف
البيرانين أو بيرسيفال إتش آر 1 مللي متر أو 20 ميكرومتر
ArcA (أرجينين ديميناز) 1 ميكرومتر
ArcB (أورنيثين كاربامويل ترانسفيراز) 2 ميكرومتر
ArcC1 (كاربامات كيناز) 5 ميكرومتر

الجدول 4: المخزن المؤقت O ومكونات التغليف. يتم سرد المكونات بترتيب الإضافة. جميع المكونات (باستثناء MgCl2 ، في الماء منزوع الأيونات) موجودة في Buffer A. يتم سرد مكونات التغليف بترتيب الإضافة. جميع البروتينات القابلة للذوبان في الماء موجودة في المخزن المؤقت E.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تتطلب إعادة تكوين البروتينات الغشائية القابلة للذوبان في الجسيمات الشحمية زعزعة استقرار الحويصلات المشكلة مسبقا. تؤدي إضافة كميات منخفضة من Triton X-100 في البداية إلى زيادة الامتصاص عند 540 نانومتر (A540) بسبب زيادة تشتت الضوء بسبب تورم الحويصلات (الشكل 4). الحد الأقصى لقيمةA 540 هو النقطة التي يتم فيها تشبع الجسيمات الشحمية بالمنظفات (Rsat) ، وبعد ذلك ستؤدي أي إضافة أخرى ل Triton X-100 إلى ذوبان جزئي للحويصلات. في Rsol ، يتم إذابة الجسيمات الشحمية تماما (الشكل 4). لإعادة تكوين البروتينات الغشائية ، نستخدم عادة الحويصلات غير المستقرة إلى 60٪ بعد Rsat (المشار إليها بالسهم).

يستخدم البروتين الغشائي المعاد تكوينه ArcD لنقل L-arginine إلى و L-ornithine خارج الحويصلات ويستخدم مع الإنزيمات المغلفة ArcA و ArcB و ArcC لإعادة تدوير ATP من ADP والفوسفات غير العضوي. GlpT هو مضاد للحمل من الجلسرين 3-فوسفات / فوسفات مع GlpK ضروري لتخليق (وإفراز) الجلسرين 3-فوسفات من الجلسرين بالإضافة إلى ATP الناتج عن انهيار L-arginine. تؤدي إضافة 5 mM L-arginine عند t = 0 إلى البروتينات إلى زيادة حادة في نسبة مضان PercevalHR عند إثارة 500 و 430 نانومتر39 ، مما يعكس نسبة ATP / ADP داخل الحويصلات (الشكل 5). عند إضافة الجلسرين ، يتم استخدام ATP لتخليق الجلسرين 3-فوسفات ، مما يؤدي إلى خفض نسبة ATP / ADP28. يؤدي انهيار L-arginine أيضا إلى تغيرات في الأس الهيدروجيني ، والتي يمكن قياسها كميا باستخدام pyranine أو pHluorin27.

Figure 5
الشكل 5: إعادة تدوير الأدينوسين الثلاثي الفوسفات بواسطة مسار انهيار إل-أرجينين. يتم وضع LUVs عند 2.7 مجم من الدهون / مل في كوفيت ويتم تسجيل نسبة التألق عند 500 نانومتر و 430 نانومتر. يضاف 5 mM من L- أرجينين عند t = 0. نسبة F500 / F430 هي مقياس لنسبة ATP / ADP داخل الحويصلات. اختصار: LUVs = حويصلات كبيرة أحادية الصفيحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يمكن أيضا استخدام LUVs المنتجة ل ATP لتشكيل GUVs. تؤدي معالجة الجفاف للبروتيو-LUVs المجففة على هلام الأغاروز LGT إلى تكوين حويصلات بحجم ميكرومتر (الشكل 6). يعتمد تكوين البروتيو-GUVs داخل بقع LUV المجففة بشكل كبير على التركيز المحلي للدهون ودرجة الجفاف. تحتوي بعض المناطق على بقع كبيرة من GUVs ، بينما في أماكن أخرى في نفس القطرة ، لا يمكن تشكيل GUVs أو عدد قليل منها. ينتج عن تكوين GUVs عبر التورم بمساعدة الأغاروز LGT مجموعة من أحجام GUV ، عادة من بضعة ميكرومتر إلى أكثر من 50 ميكرومتر.

Figure 6
الشكل 6: صور DIC للبروتيوGUVs التي تشكلت من تورم بمساعدة الهلام. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. الاختصارات: DIC = تباين التداخل التفاضلي ؛ GUVs = حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يتم حصاد GUVs واحتجازها في جهاز الموائع الدقيقة القائم على PDMS β-casein (الشكل 7). تم تصميم الجهاز بطريقة يمكن من خلالها احتجاز العديد من الحويصلات وتحليلها ضمن تجربة واحدة ، ويتم استخدام الجهاز للتحكم في البيئة الخارجية (معدل التدفق ، تكوين المخزن المؤقت ، إلخ.) 34. حتى عندما يكون محصول البروتينات - GUVs منخفضا ، فإن التدفق المستمر ل GUVs عبر رقاقة الموائع الدقيقة يمكن من جمع العديد من الحويصلات. بمجرد محاصرة عدد كاف من GUVs ، يتم غسل النظام بمخزن مؤقت متوازن تناضحيا لإزالة المكونات الخارجية مثل البروتينات القابلة للذوبان والجزيئات الصغيرة ومجسات الفلورسنت. ثم يتم استبدال مخزن الغسيل بمحلول ركيزة بأسمولية متساوية تحتوي على 50 mM KPi (درجة الحموضة 7.0) ، وكميات متفاوتة من الجلوكوز (لضبط الأسمولية) ، وركائز مثل 10 mM L-arginine. يتم إجراء تجربة سلسلة زمنية على عدة مصائد لرقاقة الموائع الدقيقة ويتم التقاط الصور كل 90 ثانية (إثارة 405 نانومتر و 488 نانومتر عند استخدام PercevalHR). علاوة على ذلك ، يتم التقاط صورة برايتفيلد في كل نقطة زمنية. نسبة شدة الانبعاث بعد الإثارة عند 488 و 405 نانومتر هي مقياس لنسبة ADP / ATP في الحويصلات.

Figure 7
الشكل 7: محاصرة الحويصلات بشريحة الموائع الدقيقة. (أ) حبس الحويصلات، مصحوبا بالقدرة على التحكم في البيئة الخارجية ومعدل التدفق. (ب) ProteoGUVs محاصرة في جهاز الموائع الدقيقة ومثارة بليزر 405 نانومتر (أخضر) و 488 ليزر (أحمر). يتم قياس الانبعاثات لكلتا القناتين عند >500 نانومتر. تسمح صورة برايت فيلد بتصور الحويصلات بدون مضان. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. اختصار: GUVs = حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقدم بروتوكولا لتخليق البروتين (الغشائي) الذي يحتوي على حويصلات دهنية بحجم أقل من ميكرومتر (proteoLUVs) ، وتحويل البروتينات LUVs إلى حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة (proteoGUVs). يجب أن يكون البروتوكول قابلا للتطبيق لإعادة تكوين البروتينات الغشائية الأخرى13،19،30،40 وتغليف الشبكات الأيضية بخلاف انهيار L-arginine ومسارات تخليق الجلسرين 3-phosphate المعروضة هنا.

تؤدي إعادة تكوين البروتينات الغشائية في الجسيمات الشحمية عموما إلى اتجاه عشوائي للبروتينات داخل الغشاء الدهني. بالنسبة إلى ArcD و Glbt ، لا يهم الاتجاه ، لأن البروتينات تعمل في اتجاهين وتتحرك المواد المذابة اعتمادا على علامة الجهد الكهروكيميائي الكلي. بالنسبة للبروتينات التي تعمل في اتجاه واحد ، لن يكون نصف الجزيئات متاحا للنشاط عندما يكون اتجاهها 50/50.

يؤدي قذف الحويصلات من خلال مرشح البولي كربونات إلى تضييق توزيع الحجم ، وتصبح الحويصلات أكثر تجانسا كلما كان حجم مسام المرشحات أصغر. ومع ذلك ، تأتي الحويصلات الأصغر بسعر وجود حجم أصغر ، وبالتالي ، عدد صغير جدا من البروتينات (الإنزيمات ، بروتينات الغشاء) لكل حويصلة. لتقليل جزء LUVs الذي يحتوي على مكون واحد أو أكثر مفقود ، يمكن تعديل تركيز البروتينات كما هو موضح في الشكل 3A ، B ولكن مع وجود حويصلات صغيرة جدا ، لا يمكن تجنب التأثيرات العشوائية.

تعتمد طريقة التورم بمساعدة الهلام على ترسب الحويصلات الصوتية (SUVs) على سطح الأغاروز المجفف. أثناء عملية التجفيف ، يتم تشكيل تدرج تركيز الحويصلات ويكون تركيز الدهون هو الأعلى في محيط البقعة. ويرجع ذلك إلى ظاهرة تعرف باسم تأثير صبغة القهوة41,42. نتيجة لذلك ، تحتوي منطقة صغيرة فقط داخل البقعة على تركيز من الدهون المناسبة لتشكيل GUV. تؤدي البقع الدهنية الدائرية غير المركزة إلى مناطق كبيرة غير مستخدمة غير متوفرة لاندماج الحويصلات. وبالتالي ، تصبح كفاءة تشكيل GUV منخفضة في هذا النهج. لزيادة إنتاجية GUVs ، يجب على المرء أن يهدف إلى ترسب الدهون بشكل موحد ، والذي يمكن تحقيقه عن طريق طلاء الدوران42 أو الاستفادة من تأثير صبغة القهوة41.

ملاحظات أخرى على البروتوكول:

يجب الحرص على إعادة تكوين العديد من البروتينات الغشائية (>10) في المتوسط لكل حويصلة لتجنب التأثيرات العشوائية. وبالتالي ، تجنب نسب الدهون إلى البروتين أعلى من 400: 1 وزن / وزن. يفترض وجود اتجاه عشوائي لمعظم البروتينات.

من الناحية المثالية ، يكون حجم البروتينات الغشائية الكلية صغيرا قدر الإمكان ولا يتجاوز على أي حال 10-20٪ من حجم الجسيمات الشحمية. ستؤدي إضافة كميات أكبر إلى إدخال المزيد من المنظفات وقد تتحلل غالبية الجسيمات الشحمية المشكلة مسبقا ، مما قد يكون له تأثير سلبي على كفاءة إعادة التكوين.

يعد التوازن المسبق للطارد مع المحلول المناسب أمرا مهما لتجنب تخفيف المكونات أثناء التغليف. من الناحية المثالية ، يجب أن يحتوي محلول الموازنة المسبقة أيضا على الإنزيمات القابلة للذوبان ، ولكن تضمين الإنزيمات يمكن أن يكون مكلفا للغاية بسبب الحجم الكبير نسبيا اللازم للتوازن المسبق للطارد. لذلك ، نحذف عادة هذه المكونات ونقبل تخفيف الإنزيمات بنسبة 5٪.

يجب إضافة الأيونات إلى المخاليط التي تحتوي على البروتيليبوزومات لأن الجزيئات كارهة للماء بدرجة عالية وقد تمتز إلى الأسطح إذا لم تكن الحويصلات موجودة. يجب الحرص على أن يكون حجم المذيب المضاف منخفضا (<1٪ من إجمالي حجم التفاعل). يتم إجراء الضوابط للتحقق من أن المذيبات لا تؤثر على شبكات التمثيل الغذائي في الحويصلات. تركيزات الأيونوفور من حوالي 1 ميكرومتر آمنة بشكل عام لتركيزات الدهون الكلية ~ 3 ملغ / مل.

يجب توخي الحذر لتجفيف القطرات جيدا. إذا لم تكن القطرات جافة بدرجة كافية ، يكون تكوين GUV أقل كفاءة لأن الدهون ستشكل مجاميع دهنية وقد تتشكل MLVs عند إضافة محلول التورم.

يستخدم الجلوكوز لمطابقة الأسمولية الخارجية للوسط الداخلي. يحتوي الأخير على السكروز بدلا من الجلوكوز لزيادة كثافة الحويصلات وبالتالي تسهيل ترسيب GUVs. علاوة على ذلك ، فإن الجلوكوز في البيئة الخارجية يعزز تباين الطور ، مما يجعل الحويصلة أكثر سهولة.

التأثيرات العشوائية أقل بكثير من مشكلة GUVs. ولكن هنا ، يمكن أن تصبح نسبة السطح إلى الحجم منخفضة بشكل غير مقبول بحيث يصبح عدد البروتينات الغشائية (على سبيل المثال ، الناقلات) مقيدا لشبكة التمثيل الغذائي الداخلية. لا تسمح الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول بالتحكم الدقيق في حجم البروتينات GUVs ولكن الغالبية تقع في نطاق حجم 5-50 ميكرومتر.

في الختام ، يقدم العمل المقدم هنا نظرة عامة شاملة على إعادة تكوين البروتين الغشائي وتغليف الإنزيم في حويصلات دهنية بأحجام مختلفة. نوضح بناء حويصلات وظيفية لتوليف ATP واللبنات الأساسية من السلائف البسيطة مثل الأحماض الأمينية والجلسرين. لا تزال إعادة تكوين البروتينات الغشائية في GUVs تمثل تحديا ، لكن البروتوكولات المقدمة هنا تمهد الطريق لمزيد من التطورات في أبحاث البيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصلحة مالية متنافسة.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون Aditya Iyer على استنساخ جين pBAD-PercevalHR و Gea Schuurman-Wolters للمساعدة في إنتاج البروتين وتنقيته. تم تمويل البحث من قبل برنامج NWO Gravitation "بناء خلية اصطناعية" (BaSyC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Aldrich A9414-25g
Amicon cut-off filter Sigma Aldrich Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra 
BioBeads BioRad 152-3920
CHCl3 Macron Fine Chemicals MFCD00000826
D(+)-Glucose Formedium -
D(+)-Sucrose Formedium -
DDM Glycon D97002 -C
Diethyl Ether Biosolve 52805
DMSO Sigma-Aldrich 276855-100ml
DOPC Avanti 850375P-1g
DOPE Avanti 850725P-1g
DOPG Avanti 840475P-1g
DTT Formedium  DTT005
EtOH J.T.Baker Avantor MFCD00003568
Extruder Avestin Inc LF-1
Fluorimeter Jasco Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol BOOM 51171608
Gravity flow column Bio-Rad 732-1010
Hamilton syringe 100 µL Hamilton 7656-01
Hamilton syringe 1000 µL Hamilton 81320
Handheld LCP dispenser Art Robbins Instruments 620-411-00
Handheld Sonicator Hielscher Ultrasound Technology UP50H
HCl BOOM x76021889.1000
Imidazole Roth X998.4-250g
K2HPO4 Supelco 1.05099.1000
KCl BOOM 76028270.1
KH2PO4 Supelco 1.04873.1000
Kimwipe Kimtech Science 7552
Large Falcon tube centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006-100G
Light microscope Leica DM LS2
L-Ornithine Roth T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670-1KG
Microfluidic chip Homemade  PDMS based DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP Sigma-Aldrich A2754-1G
NaCl Supelco 1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer Isogen Life Science ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH Supelco 1.06498.1000
Needles for GUVs Henke-Ject 14-14575 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics Henke-Ject 14-15538 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose Cytiva 17526802
Nigericin Sigma-Aldrich N7143-5MG
Nutator VWR 83007-210
Osmolality meter Gonotec Salmenkipp Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner Plasma Etch PE-Avenger
Polycarbonate filter Cytiva Whatman Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 355647
Pyranine Acros Organics H1529-1G
Quartz cuvette (black) Hellma Analytics 108B-10-40
Sephadex G-75 resin  GE Healthcare 17-0050-01
Sonicator Sonics Sonics & Materials INC Sonics vibra cell
Syringe filter Sarstedt Filtropur S plus 0.2 0.2 µm
Syringe pump Harvard Apparatus A-42467
Tabletop centrifuge Eppendorf centrifuge 5418
Teflon spacer Homemade  Teflon based 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris PanReac AppliChem A1086.1000
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100 ml
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima Max-E
UV lamp Spectroline ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer Jasco V730 spectrophotometer
Valinomycin Sigma-Aldrich V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope Zeiss AxioObserver
β-Casein Sigma Aldrich C5890-500g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
  2. Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges. Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).
  3. Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. Industrial biomanufacturing: The future of chemical production. Science. 355 (6320), (2017).
  4. Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design. Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).
  5. Wang, A., et al. Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168 (2020).
  6. Kanter, G., et al. Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines. Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).
  7. Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).
  8. Jain, K. K. Synthetic biology and personalized medicine. Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).
  9. Schwille, P., Frohn, B. P. Hidden protein functions and what they may teach us. Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).
  10. Sachsenmeier, P. Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology. Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).
  11. Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).
  12. Godoy-Hernandez, A., et al. Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions. ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).
  13. Sikkema, H. R., et al. Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA. Sci Adv. 6 (47), 7697 (2020).
  14. Foucaud, C., Poolman, B. Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport. J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).
  15. Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization. Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).
  16. Simidjiev, I., et al. Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro. Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).
  17. Harris, N. J., Booth, P. J. Folding and stability of membrane transport proteins in vitro. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).
  18. Jackson, M. L., Litman, B. J. Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).
  19. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  20. Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).
  21. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).
  22. Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1 (2023).
  23. Lee, K. Y., et al. Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system. Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).
  24. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. Methods in Enzymology. , Elsevier. 161-176 (2009).
  25. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J. Vis. Exp. (95), e52281 (2015).
  26. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  27. Pols, T., et al. A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis. Nat Commun. 10 (1), 4239 (2019).
  28. Bailoni, E., Poolman, B. ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis. ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).
  29. Van Der Heide, T. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).
  30. Van'T Klooster, J. S., et al. Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).
  31. Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations. Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).
  32. Weiss, M., et al. Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics. Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).
  33. Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown. FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).
  34. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  35. Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459 (2019).
  36. Elias, M., et al. Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette. Micro Nano Eng. 8, 100064 (2020).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 044105 (2013).
  38. Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths. Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).
  39. Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4 (1), 2550 (2013).
  40. Setyawati, I., et al. In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters. eLife. 9, e64389 (2020).
  41. Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles. Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).
  42. Estes, D. J., Mayer, M. Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).

Tags

شبكات التمثيل الغذائي خارج التوازن ، إعادة تكوين البروتين الغشائي ، الحويصلات أحادية الصفيحة الكبيرة (LUVs) ، الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) ، المفاعلات الحيوية ، المستشعرات القائمة على التألق ، تغليف الإنزيم ، تغليف الأيض
بناء شبكات التمثيل الغذائي خارج التوازن في حويصلات بحجم النانو والميكرومتر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, … More

Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, B. Construction of Out-of-Equilibrium Metabolic Networks in Nano- and Micrometer-Sized Vesicles. J. Vis. Exp. (206), e66627, doi:10.3791/66627 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter