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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln

Published: April 12, 2024 doi: 10.3791/66627
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Groningen

Summary

Wir stellen ein Protokoll zur Rekonstitution von Membranproteinen und zur Verkapselung von Enzymen und anderen wasserlöslichen Komponenten in Lipidvesikeln von Submikrometer- und Mikrometergröße vor.

Abstract

Wir stellen eine Methode vor, um komplexe Proteinnetzwerke in Vesikel einzubauen, an denen integrale Membranproteine, Enzyme und fluoreszenzbasierte Sensoren unter Verwendung gereinigter Komponenten beteiligt sind. Diese Methode ist relevant für das Design und den Bau von Bioreaktoren und die Untersuchung komplexer metabolischer Reaktionsnetzwerke außerhalb des Gleichgewichts. Wir beginnen mit der Rekonstitution von (mehreren) Membranproteinen zu großen unilamellären Vesikeln (LUVs) nach einem zuvor entwickelten Protokoll. Anschließend verkapseln wir ein Gemisch aus gereinigten Enzymen, Metaboliten und fluoreszenzbasierten Sensoren (fluoreszierende Proteine oder Farbstoffe) mittels Gefrier-Auftau-Extrusion und entfernen nicht eingebaute Komponenten durch Zentrifugation und/oder Größenausschlusschromatographie. Die Leistung der Stoffwechselnetzwerke wird in Echtzeit gemessen, indem das ATP/ADP-Verhältnis, die Metabolitenkonzentration, der interne pH-Wert oder andere Parameter durch Fluoreszenzauslesung überwacht werden. Unsere Membranprotein-haltigen Vesikel mit einem Durchmesser von 100-400 nm können mit bestehenden, aber optimierten Verfahren in riesig-unilamelläre Vesikel (GUVs) umgewandelt werden. Der Ansatz ermöglicht den Einbau löslicher Komponenten (Enzyme, Metaboliten, Sensoren) in mikrometergroße Vesikel, wodurch das Volumen der Bioreaktoren um Größenordnungen vergrößert wird. Das metabolische Netzwerk, das GUVs enthält, wird in mikrofluidischen Geräten gefangen, um sie mit optischer Mikroskopie zu analysieren.

Introduction

Der Bereich der synthetischen Biologie von unten konzentriert sich auf die Konstruktion von (minimalen) Zellen 1,2 und metabolischen Bioreaktoren für biotechnologische 3,4 oder biomedizinische Zwecke 5,6,7,8. Die Konstruktion synthetischer Zellen bietet eine einzigartige Plattform, die es Forschern ermöglicht, (Membran-)Proteine unter genau definierten Bedingungen zu untersuchen, die denen der natürlichen Umgebung nachahmen, und ermöglicht so die Entdeckung von emergenten Eigenschaften und verborgenen biochemischen Funktionen von Proteinen und Reaktionsnetzwerken9. Als Zwischenschritt hin zu einer autonom funktionierenden synthetischen Zelle werden Module entwickelt, die wesentliche Merkmale lebender Zellen wie metabolische Energieerhaltung, Protein- und Lipidsynthese sowie Homöostase erfassen. Solche Module erweitern nicht nur unser Verständnis des Lebens, sondern haben auch Anwendungsmöglichkeiten in den Bereichen Medizin8 und Biotechnologie10.

Transmembranproteine sind das Herzstück praktisch jedes Stoffwechselnetzwerks, da sie Moleküle in oder aus der Zelle transportieren, Signale senden und auf die Qualität der Umwelt reagieren und zahlreiche biosynthetische Rollen spielen. Daher erfordert das Engineering von Stoffwechselmodulen in synthetischen Zellen in den meisten Fällen die Rekonstitution von integralen und/oder peripheren Membranproteinen zu einer Membrandoppelschicht, die aus spezifischen Lipiden besteht und eine hohe Integrität (geringe Permeabilität) aufweist. Der Umgang mit diesen Membranproteinen ist anspruchsvoll und erfordert spezifisches Wissen und experimentelle Fähigkeiten.

Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um Membranproteine in Phospholipid-Vesikeln zu rekonstituieren, meist mit dem Ziel, die Funktion11,12, die Regulation13, die kinetischen Eigenschaften14,15, die Lipidabhängigkeit15,16 und/oder die Stabilität17 eines spezifischen Proteins zu untersuchen. Diese Verfahren umfassen die rasche Verdünnung von durch Detergenzien gelöstem Protein in wässrigen Medien in Gegenwart von Lipiden18, die Entfernung von Detergenzien durch Inkubation von durch Detergenzien gelöstes Protein mit detergenzient destabilisierten Lipidvesikeln und die Absorption des Detergens bzw. der Detergenzien auf Polystyrolkügelchen19 oder das Entfernen von Detergenzien durch Dialyse oder Größenausschlusschromatographie20. Organische Lösungsmittel wurden verwendet, um Lipidvesikel zu bilden, z. B. durch die Bildung von Öl-Wasser-Interphasen21, aber die Mehrzahl der integralen Membranproteine wird inaktiviert, wenn sie solchen Lösungsmitteln ausgesetzt werden.

In unserem Labor rekonstituieren wir hauptsächlich Membranproteine mit der Detergenz-Absorptionsmethode zu großen unilamellären Vesikeln (LUVs)19. Dieses Verfahren ermöglicht die Co-Rekonstitution mehrerer Membranproteine und die Verkapselung von Enzymen, Metaboliten und Sonden im Vesikellumen22,23. Die Membranprotein-haltigen LUVs können in riesen-unilamelläre Vesikel (GUVs) mit/ohne Verkapselung wasserlöslicher Komponenten umgewandelt werden, wobei entweder die Elektroformation24 oder die gelgestützte Quellung25 und spezifische Bedingungen zur Erhaltung der Integrität der Membranproteine26 verwendet werden.

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Rekonstitution eines außerhalb des Gleichgewichts befindlichen metabolischen Netzwerks in LUVs vorgestellt, das ATP durch den Abbau von L-Arginin in L-Ornithin regeneriert27. Die Bildung von ATP ist an die Produktion von Glycerin-3-phosphat (G3P) gekoppelt, einem wichtigen Baustein für die Phospholipidsynthese22,28. Der Stoffwechselweg besteht aus zwei integralen Membranproteinen, einem Arginin/Ornithin (ArcD) und einem G3P/Pi-Antiporter (GlpT). Darüber hinaus werden drei lösliche Enzyme (ArcA, ArcB, ArcC) für das Recycling von ATP benötigt, und GlpK wird verwendet, um Glycerin in Glycerin-3-phosphat umzuwandeln, wobei das ATP aus dem Abbau von L-Arginin verwendet wird, siehe Abbildung 1 für einen schematischen Überblick über den Weg. Dieses Protokoll stellt einen guten Ausgangspunkt für den zukünftigen Aufbau noch komplexerer Reaktionsnetzwerke dar - für die Synthese von Lipiden oder Proteinen oder die Teilung von Zellen. Die Lipidzusammensetzung der Vesikel unterstützt die Aktivität einer Vielzahl von integralen Membranproteinen und wurde für den Transport verschiedener Moleküle in oder aus den Vesikeln optimiert 27,29,30.

Figure 1
Abbildung 1: Überblick über den Weg der ATP-Produktion und der Glycerin-3-phosphat-Synthese und -Ausscheidung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Kurz gesagt, gereinigte Membranproteine (solubilisiert in Dodecyl-β-D-Maltosid, DDM) werden zu vorgeformten Lipidvesikeln hinzugefügt, die mit Triton X-100 destabilisiert wurden, was die Insertion der Proteine in die Membran ermöglicht. Die Detergensmoleküle werden anschließend (langsam) durch die Zugabe von aktivierten Polystyrolkügelchen entfernt, was zur Bildung von gut verschlossenen Proteoliposomen führt. Lösliche Bestandteile können dann zu den Vesikeln hinzugefügt und über Gefrier-Tau-Zyklen verkapselt werden, wodurch die Moleküle im Prozess der Membranfusion eingefangen werden. Die gewonnenen Vesikel sind sehr heterogen und viele sind multilamell. Sie werden dann durch einen Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 400, 200 oder 100 nm extrudiert, was zu gleichmäßiger großen Vesikeln führt; Je kleiner die Porengröße, desto homogener und unilamellär sind die Vesikel, jedoch zum Preis eines kleineren inneren Volumens. Nicht eingebaute Proteine und kleine Moleküle werden durch Größenausschlusschromatographie aus der externen Lösung entfernt. Die proteoLUVs können durch gelgestütztes Aufquellen in mikrometergroße Vesikel umgewandelt werden, und diese proteoGUVs werden dann gesammelt und in einem mikrofluidischen Chip zur mikroskopischen Charakterisierung und Manipulation gefangen. Abbildung 2 zeigt einen schematischen Überblick über das gesamte Protokoll.

Figure 2
Abbildung 2: Überblick über das Protokoll zur Rekonstitution von Membranproteinen und zur Verkapselung von Enzymen und wasserlöslichen Komponenten in Lipidvesikeln mit Submikrometer- (LUVs) und Mikrometergröße (GUVs). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Rekonstitutions- und Verkapselungsprotokolle funktionieren gut und die Funktionalität der Proteine bleibt erhalten, aber die proteoLUVs und proteoGUVs sind heterogen groß. Mikrofluidische Ansätze 31,32 ermöglichen die Bildung von mikrometergroßen Vesikel, die in ihrer Größe homogener sind, aber eine funktionelle Rekonstitution von Membranproteinen ist im Allgemeinen nicht möglich, da das restliche Lösungsmittel in der Doppelschicht die Proteine inaktiviert. Die ProteoLUVs haben eine Größe von 100 bis 400 nm, und bei niedrigen Enzymkonzentrationen kann die Verkapselung zu Vesikeln mit unvollständigen Stoffwechselwegen führen (stochastische Effekte; siehe Abbildung 3). LUVs sind ideal für den Aufbau spezifischer Stoffwechselmodule, wie hier gezeigt, für die Produktion von ATP und Bausteinen wie G3P. Solche proteoLUVs können möglicherweise in GUVs eingekapselt werden und als organellenähnliche Kompartimente für die Wirtsvesikel dienen.

Figure 3
Abbildung 3: Anzahl der Moleküle pro Vesikel mit einem Durchmesser von 100, 200 oder 400 nm. (A) Wenn die verkapselten Proteine (Enzyme, Sonden) im Bereich von 1-10 μM liegen. (B) Die Rekonstitution erfolgt bei 1 bis 1.000, 1 bis 10.000 und 1 bis 100.000 Membranproteinen pro Lipid (mol/mol). Wir gehen davon aus, dass Moleküle in den angegebenen Konzentrationen verkapselt und bei diesen Protein-Lipid-Verhältnissen in die Membran eingebaut werden. Bei einigen Enzymen haben wir gesehen, dass sie an Membranen binden, was ihre scheinbare Konzentration in den Vesikeln erhöhen kann. Abkürzung: LPR = Lipid-Protein-Ratio Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protocol

1. Allgemeine Vorbereitung

  1. Chemikalien
    1. Lösen Sie Lipide (in Pulverform) auf 25 mg/ml in CHCl3 auf, um vorgeformte Liposomen herzustellen.
      HINWEIS: Es ist vorzuziehen, frische Lipide herzustellen, aber die Stammlösungen können auch einige Wochen bei -20 °C gelagert werden. Die Arbeit mit Lipiden in Pulverform ist genauer als die Verwendung von Lipiden, die bereits in CHCl3 solubilisiert sind. CHCl3 sollte mit Glaspipetten und/oder Spritzen gehandhabt und in Glasbehältern aufbewahrt werden, da CHCl3 Kunststoffe auflöst.
    2. Kleine Moleküle (Nukleotide, Aminosäuren, Fluoreszenzsonden) für das Verkapselungsverfahren in 50 mM KPi (Puffer A, siehe Tabelle 1) auflösen und den pH-Wert auf 7,00 ± 0,01 einstellen. MgCl2 in deionisiertem Wasser auflösen, um die Bildung von Magnesiumphosphatausfällungen zu vermeiden.
      HINWEIS: Stammlösungen können einige Wochen lang bei -20 °C gelagert werden, mit Ausnahme von DVB-T, das am Tag des Versuchs frisch zubereitet wird.
    3. Ionophore (z. B. Valinomycin, Nigericin) in DMSO oder EtOH in einer Stammkonzentration von 100-500 μM auflösen. Einige Wochen bei -20 °C lagern; Verdunstung vermeiden.
      HINWEIS: DMSO ist nicht flüchtig und daher gegenüber EtOH bevorzugt. Verwenden Sie Glas- anstelle von Plastikfläschchen, um ein Anhaften der Ionophore an der Oberfläche der Fläschchen zu vermeiden.
  2. Puffer
    1. Bereiten Sie am Tag des Versuchs frische Puffer vor (Tabelle 1). Nicht länger als 24 h lagern.
  3. Reinigung löslicher Proteine
    1. Express ArcA, ArcB, ArcC (wir verwenden eine spezielle Variante namens ArcC1), PercevalHR und GlpK, wie zuvor beschrieben 27,28,33. Stellen Sie sicher, dass Sie dem Zelllysepuffer 10 % v/v Glycerin hinzufügen, was die Stabilität der Proteine erhöht. Reinigen Sie die löslichen Proteine, wiebeschrieben 27,28,33 und kurz nachstehend berichtet.
    2. Tauen Sie 10 mL Zelllysat (~5 g Nassgewicht) in einem Eiswasserbad auf. Tragen Sie in der Zwischenzeit 2 mL (1 CV) Ni2+-Sepharoseharz auf eine Schwerkraftflusssäule (20 mL Kapazität) mit deionisiertem Wasser (12 CVs) und Puffer B (4 CVs) zum Waschen auf. Übertragen Sie das aufgetaute Lysat auf Eis; Arbeiten Sie auf Eis, sofern nicht anders angegeben.
    3. Geben Sie Imidazol bis zu einer Endkonzentration von 10 mM in das aufgetaute Lysat und gießen Sie dann die Lösung auf die Schwerkraftsäule. 1 Stunde lang bei 4 °C unter sanfter Nutation inkubieren.
    4. Nach 1 h verwerfen Sie den Durchfluss und waschen Sie das Harz mit Puffer C (20 CVs).
    5. Eluieren Sie das Protein mit Puffer D. Verwenden Sie 60 % CV für den ersten Elutionsschritt, gefolgt von 4-6 Schritten mit 40 % CVs.
    6. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration und fügen Sie Na-EDTA bis zu einer Endkonzentration von 5 mM hinzu.
    7. Schleudern Sie das gereinigte Protein in einer gekühlten Tischzentrifuge herunter (max. Drehzahl, 10 Minuten, 4 °C). Aufreinigung durch Größenausschlusschromatographie mit Puffer E. Die Elutionsfraktionen werden zusammengefasst und mit einem Konzentrationsfilter mit einem Cutoff-Wert von 30 kDa auf ~10 mg/ml konzentriert. Aliquots geeigneter Größe (~ 20 μl) vorbereiten, mit flüssigem Stickstoff schockfrosten und für die spätere Verwendung bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Enzyme auf 50-100 μM zu konzentrieren, um das für die Verkapselung benötigte Volumen zu minimieren.
  4. Aufreinigung von Membranproteinen
    1. Überexpress ArcD und GlpT wie zuvor beschrieben 22,27,33. Stellen Sie sicher, dass Sie dem Zelllysepuffer 10 % v/v Glycerin hinzufügen. Für die Aufreinigung von ArcD sind 2 mM Reduktionsmittel (z. B. DTT) in den Puffer zu geben. Aufreinigung der affinitätsmarkierten Proteine durch Ni2+-Sepharosechromatographie.
      1. Ein Aliquot von rohen Membranvesikeln (10-20 mg Gesamtmembranprotein) wird in einem Eiswasserbad aufgetaut.
        HINWEIS: Nach dem Auftauen immer auf Eis arbeiten, sofern nicht anders angegeben. In Tabelle 1 finden Sie die in diesem Abschnitt verwendeten Puffer.
      2. Geben Sie die Membranvesikel in Puffer F (ArcD) oder Puffer G (GlpT) bis zu einem Endvolumen von 6 mL. Die Probe wird 1 h lang bei 4 °C unter sanfter Nutation inkubiert.
      3. Trennen Sie die löslichen Membranproteine durch Ultrazentrifugation (337.000 × g, 30 min, 4 °C) von den Membranresten. In der Zwischenzeit tragen Sie 0,25 mL (1 CV) Ni2+-Sepharoseharz auf eine Schwerkraftflusssäule (10 mL Kapazität) mit deionisiertem Wasser (40 CVs) und 20 CVs Puffer H (ArcD) oder Puffer I (GlpT) auf.
      4. Gießen Sie das lösliche Protein auf die Schwerkraftflusssäule und fügen Sie Imidazol bis zu einer Endkonzentration von 10 mM hinzu. 1 h bei 4 °C unter sanfter Nutation inkubieren.
      5. Nach 1 h verwerfen Sie den Durchfluss und waschen Sie das Harz mit 20 CVs Buffer J (ArcD) oder Buffer K (GlpT).
      6. Eluieren Sie das Membranprotein in Schritten von 60 % CV (1st) und 40 % CV (2nd-6 th) mit Buffer L (ArcD) oder Buffer M (GlpT).
      7. Die Proteinkonzentration ist zu bestimmen und mit Abschnitt 2.2 fortzufahren. für die Rekonstitution der Membran.
        HINWEIS: Die Größenausschlussreinigung wird nicht unbedingt für Membranproteine durchgeführt, da die Membranrekonstitution eine ähnliche Reinigung ergibt. Die Schritte 1.4 und 2.2 können an 1 Arbeitstag durchgeführt werden. Beginnen Sie mit der Proteinreinigung (Schritt 1.4) am Morgen und fahren Sie mit der Rekonstitution (Schritt 2.2) am Nachmittag fort. Die Rekonstitution endet am folgenden Tag (siehe Abschnitt 2.2 für Details). HALTEPUNKT: Aufgereinigtes und DDM-solublisiertes ArcD und GlpT können für die spätere Verwendung bei -80 °C gelagert werden, dies gilt jedoch nicht für alle Membranproteine. Aliquots geeigneter Größe (50-200 μl) vorbereiten, mit flüssigem Stickstoff schockfrosten und für die spätere Verwendung bei -80 °C lagern. Diese Proteine sind mehrere Monate lang aktiv, wenn sie bei -80 °C in Gegenwart von 10 % v/v Glycerin gelagert werden.
  5. Vorbereitung von β-Kasein für Passivierungszwecke
    1. 100 mg β-Kasein in 20 ml deionisiertem Wasser resuspendieren und mit 1 M NaOH titrieren, bis das β-Kasein vollständig aufgelöst ist. Fügen Sie dann 1 M Essigsäure hinzu, um den pH-Wert auf 7,0 einzustellen, und füllen Sie das Volumen auf 50 mL mit deionisiertem Wasser. Die Lösung wird durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter filtriert und Aliquote von 500 μl hergestellt.
      HINWEIS: Das β-Kasein kann 6 Monate bei -20 °C gelagert werden. Es wird empfohlen, das β-Kasein vor der Verwendung erneut zu filtrieren, um zu verhindern, dass β-Kasein-Aggregate den Mikrofluidik-Chip verstopfen.

Puffer Zusammensetzung
Puffer A 50 mM KPi pH 7,0
Puffer B 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10 % v/v Glycerin, 10 mM Imidazol, pH 7,5
Puffer C 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10 % v/v Glycerin, 50 mM Imidazol, pH 7,5
Puffer D 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10 % v/v Glycerin, 500 mM Imidazol, pH 7,5
Puffer E 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10 % v/v Glycerin, pH 7,0
Puffer F 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,5 % w/v DDM, 10 % v/v Glycerin, 2 mM β-Mercaptoethanol, pH 7,5
Puffer G 50 mM Tris-HCl, 0,5 % w/v DDM, 20 % v/v Glycerin, pH 8
Puffer H 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,02 % w/v DDM, 10 % v/v Glycerin, 2 mM β-Mercaptoethanol, 10 mM Imidazol, pH 7,5
Puffer I 50 mM Tris-HCl, 0,04 % w/v DDM, 20 % v/v Glycerin, 10 mM Imidazol, pH 8,0
Puffer J 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02 % w/v DDM, 10 % v/v Glycerin, 2 mM β-Mercaptoethanol, 50 mM Imidazol, pH 7,5
Puffer K 50 mM Tris-HCl, 0,04 % w/v DDM, 20 % v/v Glycerin, 50 mM Imidazol, pH 8
Puffer L 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02 % w/v DDM, 10 % v/v Glycerin, 2 mM β-Mercaptoethanol, 500 mM Imidazol, pH 7,5
Puffer M 50 mM Tris-HCl, 0,04 % w/v DDM, 20 % v/v Glycerin, 500 mM Imidazol, pH 8
Puffer N 50 mM KPi, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0
Puffer O 50 mM KPi, 0,5 mM L-Ornithin, 10 mM Na-ADP, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, pH 7,0
Puffer P 50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, x mM Glukose (x wird variiert, um der Osmolarität des externen und internen Mediums zu entsprechen)
Puffer Q 50 mM KPi pH 7,0, 0,5 mM Saccharose, 2 mM DTT
Puffer R 50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, 10 mM L-Arginin, x mM Glukose

Tabelle 1: In diesem Protokoll verwendete Puffer.

2. Proteoliposomen: Rekonstitution von gereinigten Membranproteinen in vorgeformte Lipidvesikel

  1. Tag 1
    1. Präparation von vorgeformten Lipidvesikeln
      1. Wählen Sie die Lipidzusammensetzung (z.B. synthetische Phospholipide, E. coli polare Lipide) auf Basis der Anforderungen der Membranproteine.
        HINWEIS: Eine Mischung aus DOPE, DOPG und DOPC (25:25:50 mol%) ist ein guter Ausgangspunkt, aber für einige Proteine können Sterole oder Cardiolipin erforderlich sein; Für Hefe-Plasmamembranproteine schließen wir Palmitoyl-Oleoyl-Lipide anstelle von Dioleoyl30 ein. Ein DOPE-, DOGG- und DOPC-Gemisch (25:25:50 mol%) reicht für die Rekonstitution von ArcD und GlpT aus.
      2. Mischen Sie die gewünschten Lipide (solubilisiert inCHCl 3) und verdampfen Sie das CHCl3 in einem Rotationsverdampfer, bis sich ein Lipidfilm bildet. Waschen Sie die Lipide, indem Sie Diethylether in gleichem Volumen wieCHCl 3 hinzufügen. Verdampfen Sie den Diethylether und erhalten Sie einen trockenen Lipidfilm.
      3. Resuspendieren Sie den Lipidfilm auf 20 mg/ml Gesamtlipide in wässrigen Medien (Puffer A). Beginnen Sie mit der Hälfte des Gesamtvolumens und schütteln Sie es leicht; Füllen Sie dann die Lipide vorsichtig in ein sauberes Röhrchen oder eine Flasche mit ausreichender Größe um. Frischer Puffer A in den Kolben geben und den Vorgang wiederholen, um die restlichen Lipide aufzulösen und in ein neues Gefäß zu überführen. Fügen Sie zusätzlichen Puffer A hinzu, um eine Endkonzentration von 20 mg/ml zu erreichen.
      4. Beschallung der resuspendierten Lipide mit einem Sonden-Ultraschallgerät. Für eine Ultraschalldüse mit einem Durchmesser von 6 mm sind folgende Parameter zu verwenden: 4 μm Intensität, 70 % Amplitude, 5 s an, 45 s aus, 16 Zyklen. Tauchen Sie die Lipide in ein Eiswasserbad, das EtOH enthält, um eine Überhitzung durch Ultraschall zu vermeiden.
      5. Die beschallte Probe (Volumen von 40 mL in einem 50 mL-Zentrifugenröhrchen) wird in flüssigem Stickstoff schockgefroren und die Probe in einem Wasserbad bei Raumtemperatur aufgetaut. Einmal wiederholen; dann aliquotieren Sie die Liposomen in den gewünschten Volumina (z. B. 1 ml oder 20 mg Gesamtlipide in einem 1,5 ml-Kunststoffröhrchen).
        STOPPPUNKT: An dieser Stelle kann der Vorgang gestoppt werden. Jedes Aliquot noch einmal schockfrosten (dritter Zyklus) und bis zu einigen Monaten in flüssigem Stickstoff lagern. Achten Sie darauf, die Tubendeckel zweimal mit einer Nadel zu durchstechen, um eine Explosion der Tube beim schnellen Sieden des flüssigen Stickstoffs zu vermeiden.
  2. Tag 2
    1. Rekonstitution von gereinigten Membranproteinen in vorgeformte Liposomen
      1. Tauen Sie ein Aliquot von Liposomen (20 mg Gesamtlipide) in einem Wasserbad bei Raumtemperatur auf. Bereiten Sie in der Zwischenzeit einen Extruder vor, indem Sie einen Filter Ihrer Wahl auftragen (z. B. Polycarbonat, Porendurchmesser von 400 nm); den Extruder mit Puffer A voräquilibrieren; und laden Sie die aufgetauten Liposomen ("Milchlösung") in den Extruder und passieren Sie sie 13x durch den Filter. Sammeln Sie die extrudierten Liposomen (jetzt große unilamelläre Vesikel; "undurchsichtige Lösung") in einem Glas- oder Kunststoffgefäß ausreichender Größe (z. B. 15 ml). Verdünnen Sie die Liposomen auf 4 mg/ml mit Puffer A, der mit 2 mM DTT ergänzt wird.
      2. Übertragen Sie 1 ml 4 mg/ml-Liposomen in eine transparente 1-ml-Küvette. Messen Sie in einem Spektralphotometer die anfängliche optische Dichte bei 540 nm. Gießen Sie die gemessene Probe zurück und geben Sie 50 μl 10 % v/v Triton X-100 zu den Liposomen.
        HINWEIS: Ein Titrationsvolumen von 50 μl 10 % Triton-X100 ist für 20 mg Lipide in einem Volumen von 5 ml geeignet; die Zugabe von Triton X-100 verdünnt die Lipide um ~5%. Passen Sie das Titrationsvolumen an, wenn Sie mit unterschiedlichen Mengen an Liposomen arbeiten. Für stabile optische Dichtesignale titrieren Sie die Liposomen mit Triton X-100 bei Raumtemperatur.
      3. Wiederholen Sie Schritt 2.2.1.2 und notieren Sie, wann eine maximale optische Dichte (Rsat) erreicht ist. Fahren Sie mit der Titration fort, bis eine optische Dichte von etwa 60 % Rsat erreicht ist (Abbildung 4). Gießen Sie die durch das Reinigungsmittel destabilisierten Vesikel zurück in das Glas-/Kunststoffröhrchen (das endgültige Volumen beträgt jetzt ca. 5,2 ml), geben Sie die Probe auf Eis und lassen Sie sie abkühlen.
      4. Fügen Sie das/die gereinigte(n) Membranprotein(e) zu den destabilisierten Liposomen hinzu, um ein gewünschtes Lipid-Protein-Verhältnis (w/w) zu erreichen. Verwenden Sie ein Verhältnis von 400:1 bis 100:1 w/w; Da sowohl ArcD als auch GlpT ein Molekulargewicht von ~55 kDa haben, entspricht ein Lipid-Protein-Verhältnis von 400:1 w/w ~30.000 Lipiden pro Protein und jeweils ~ 50 Molekülen ArcD und GlpT pro Vesikel mit einem Durchmesser von 400 nm.
        HINWEIS: Hier verwenden wir 400:1 w/w, was 50 μg jedes Proteins pro 20 mg Lipide entspricht.
      5. Die Proben werden 15 Minuten lang bei 4 °C nutatiert, damit sich die Membranproteine in die destabilisierte liposomale Membran einfügen können.
      6. Um das Reinigungsmittel zu entfernen, fügen Sie 200 mg trockene Polystyrolkügelchen hinzu, die gemäß den Anweisungen des Herstellers zubereitet wurden. Bei 4 °C weitere 15 Min. erhitzen.
        HINWEIS: Eine Menge von 200 mg Trockenkügelchen ist für 20 mg Lipide geeignet, sollte jedoch angepasst werden, wenn eine andere Probengröße verwendet wird.
      7. Schritt 2.2.1.6 2x wiederholen, um insgesamt drei Zusätze von Polystyrolkügelchen zu erhalten. Dann über Nacht bei 4 °C unter sanfter Nutation inkubieren.
  3. Tag 3
    1. Schritt 2.2.1.6 wiederholen; Diesmal jedoch 1 h lang bei 4 °C nutatieren.
    2. Befestigen Sie eine leere Schwerkraft-Flow-Säule (10 mL Kapazität) über einem leeren 6,5 mL Ultrazentrifugationsröhrchen auf Eis. Gießen Sie die Probe in die Säule und sammeln Sie die Proteoliposomen im Ultrazentrifugationsröhrchen (die Kügelchen werden in der Säule zurückgehalten).
    3. Waschen Sie die Kügelchen mit 0,5 mL Puffer A, ergänzt mit 2 mM DTT, und sammeln Sie das Filtrat im Ultrazentrifugationsröhrchen.
    4. Konzentrieren Sie die Proteoliposomen durch Ultrazentrifugation (337.000 × g, 30 min, 4 °C). Resuspendieren Sie die Proteoliposomen in einem Gesamtvolumen von 200 μl (100 mg Lipid/ml) in Puffer A, ergänzt mit 2 mM DTT; Das Trockenvolumen der Vesikel nach der Zentrifugation beträgt ~40 bis 120 μL27. Aufgeteilt in Aliquots der gewünschten Größe (z. B. drei Aliquots mit 6,66 mg Gesamtlipiden).
      HINWEIS: Die aliquote Größe ist willkürlich, wirkt sich aber in späteren Schritten auf die Pelletgröße aus (siehe Schritt 3.2.3.1). STOPPPUNKT: Hier kann der Vorgang gestoppt werden. Jedes Aliquot schockfrosten und bis zu einigen Wochen in flüssigem Stickstoff lagern. Achten Sie darauf, die Tubendeckel zweimal mit einer Nadel zu durchstechen, um eine Explosion der Tube beim schnellen Sieden des flüssigen Stickstoffs zu vermeiden.

Figure 4
Abbildung 4: Titration von vorgeformten Liposomen mit Triton X-100. Liposomen mit 5 mg Lipiden/ml werden durch einen Polycarbonatfilter (400 nm) in 50 mM KPi (pH 7,0) extrudiert und dann mit Triton X-100 titriert (Protokollschritt 2.2.1.2). Die Trübung der Vesikel wird bei A540 gemessen. Der Pfeil zeigt die Triton X-100-Konzentration an, bei der die Vesikel ausreichend destabilisiert sind, um eine spontane Insertion von Membranproteinen zu ermöglichen, wie in19 beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Verkapselung eines metabolischen Netzwerks für ATP-Recycling und Glycerin-3-P-Synthese in submikrongroßen Vesikeln

  1. Tag 1
    1. Mischen von Komponenten
      1. Für eine Standardverkapselung verwenden Sie 66,6 μl Proteoliposomen in einem Endvolumen von 200 μl (33,33 mg/ml Gesamtlipide). Berechnen Sie das Volumen jeder Komponente (Enzym, Cofaktor), das benötigt wird, um die gewünschte Konzentration zu erreichen, fügen Sie diese Komponenten zu den Proteoliposomen hinzu und stellen Sie das Volumen mit Puffer A auf 200 μl ein (Tabelle 2).
        HINWEIS: Die Proteinkonzentration kann basierend auf dem Versuchsaufbau angepasst werden. Es sollte jedoch darauf geachtet werden, dass durchschnittlich mehrere Kopien (>10) jedes Enzyms pro Vesikel vorhanden sind, um unerwünschte stochastische Effekte zu vermeiden. Konzentrationen > 1 μM sind im Allgemeinen sicher; 1 μM in einem Vesikel mit einem Durchmesser von 400 nm entspricht etwa 20 Kopien (Abbildung 3).
      2. Pipettieren Sie Puffer A in ein leeres 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie DTT, Na-ADP, MgCl2, L-Ornithin (und Pyranin, falls für interne pH-Messungen erforderlich) hinzu. Als nächstes die Enzyme hinzufügen und vorsichtig mischen. Geben Sie die Lösung auf die vorgeformten Proteoliposomen und wirbeln Sie sie kurz bei niedriger Geschwindigkeit durch.
        HINWEIS: Es ist wichtig, Na-ADP vor MgCl2 hinzuzufügen, um die unerwünschte Bildung von Magnesiumphosphatausfällungen zu vermeiden. Für das richtige Mischen der viskosen Lösung ist ein Vortexen erforderlich. Minimieren Sie jedoch die Dauer und Geschwindigkeit, um mechanische Schäden an den Proteinen zu vermeiden. PercevalHR und Pyranin können nicht gemeinsam verkapselt werden, da sich ihre Spektren überlappen.
    2. Bestimmung der internen Osmolalität
      1. Bereiten Sie eine 50-μl-Lösung wie in Schritt 3.1.1.1 beschrieben, jedoch ohne Proteoliposomen, vor und messen Sie die Osmolalität mit einem Gefrierpunktosmometer.
      2. Erstellen Sie eine Kalibrierkurve mit Puffer (50 mM KPi, pH 7,0) und unterschiedlichen Konzentrationen von Salz (z. B. NaCl oder NaCl) oder Zucker. Bestimmen Sie die Osmolytkonzentration, die der internen Osmolalität (Puffer N) entspricht.
        HINWEIS: Membranpermeable Komponenten (z. B. Glycerin) können nicht verwendet werden, um die interne Osmolalität anzupassen. Für Proteine, die in glycerinhaltigem Puffer (z. B. Puffer E) solubilisiert sind, sollte derselbe Puffer ohne Glycerin verwendet werden. Der für die Herstellung eines isoosmotischen externen Puffers gewählte Osmolyt sollte membranundurchlässig sein und nicht in das metabolische Netzwerk eingreifen.
    3. Frost-Auftauen
      1. Die Proteoliposomen werden zusammen mit den löslichen Bestandteilen schockgefroren (in flüssigem Stickstoff) und in einem Wasser-Eis-Bad bei ca. 10 °C aufgetaut.
      2. Wiederholen Sie Schritt 3.1.3.1 für insgesamt 5x.
        STOPPPUNKT: Hier kann der Vorgang gestoppt werden. Überspringen Sie den letzten Auftauschritt und lagern Sie die gefrorene Probe 1-3 Tage lang in flüssigem Stickstoff. Achten Sie darauf, die Tubendeckel 2x mit einer Nadel zu durchstechen, um eine Explosion der Tube beim schnellen Sieden des flüssigen Stickstoffs zu vermeiden. Die Lagerung in flüssigem Stickstoff wird über -80 °C bevorzugt, um die Lipidoxidation zu minimieren.
  2. Tag 2
    1. Extrusion
      HINWEIS: Alle Extrusionsschritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, da sonst die gasdichten Spritzen undicht werden.
      1. Bereiten Sie einen Extruder vor, indem Sie einen Filter Ihrer Wahl anwenden (z. B. Polycarbonat, Porendurchmesser von 400 nm). Waschen Sie den Extruder mit einer Lösung, die den gleichen Puffer und die gleichen Metaboliten enthält, die für die Verkapselung der Vesikel verwendet wurden (z. B. Puffer O plus 0,1 mM Pyranin).
        HINWEIS: Verwenden Sie einen speziellen Extruder für die Beladung von Proteoliposomen mit Pyranin, da der Farbstoff an der Extruderoberfläche haftet und in späteren Proben zu einer Kontamination führen kann.
      2. Laden Sie das Verkapselungsgemisch in den Extruder und leiten Sie es 13x durch den Filter. Sammeln Sie die extrudierte Lösung in einem 1,5-ml-Röhrchen.
    2. Größenausschlusschromatographie (optional)
      HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um externe Moleküle wie Farbstoffe wie Pyranin durch Größenausschlusschromatographie zu entfernen. Wenn keine Farbstoffe im System vorhanden sind und andere Komponenten bei niedrigen Konzentrationen nicht stören (beachten Sie, dass die Vesikel anschließend auch durch Ultrazentrifugation gewaschen werden), dann Schritt 3.2.2. kann übersprungen werden.
      1. Rehydrieren Sie das Harz Sephadex G-75 und gießen Sie es in eine Glassäule (22 cm lang, 1,5 cm breit). Äquilibrieren Sie das Harz mit einem Überschuss an externem Puffer (z. B. Puffer N).
      2. Die extrudierten Proteoliposomen aus Schritt 3.2.1.2 werden auf die präequilibrierte Größenausschlusschromatographiesäule geladen und eine Schwerkraftströmung aus externem Puffer angelegt. Entsorgen Sie das Hohlraumvolumen (ca. 7 ml); Sammeln Sie dann zehn 1-ml-Aliquots. Visualisieren Sie die Proteoliposomen-haltigen Aliquots durch kurze Einwirkung einer UV-Lampe. Bündeln Sie die Fraktionen, die die meisten Proteoliposomen (2-4 mL) enthalten.
    3. Waschen und Resuspension
      1. Waschen Sie die extrudierten Proteoliposomen durch Ultrazentrifugation. Füllen Sie ein 6,5-ml-Ultrazentrifugationsröhrchen mit 5,8 mL Puffer N und tragen Sie die extrudierte Probe darauf auf. Wenn eine Größenausschlusschromatographie durchgeführt wurde, füllen Sie das Röhrchen mit den gepoolten Elutionsproben (2-4 mL) und fügen Sie Puffer N zu einem Endvolumen von 6 mL hinzu.
      2. Zentrifugieren bei 337.000 × g, 30 min, 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Ultrazentrifugationsröhrchen gründlich mit einem staubfreien Tuch ab, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu berühren. Resuspendieren Sie das Pellet in einem kleinen Volumen Puffer N (200 μl). Wenn das Pellet vollständig resuspendiert ist, füllen Sie das Röhrchen bis zu 6 mL mit Puffer N.
        HINWEIS: Das Wiederaufhängen des Pellets nimmt einige Zeit in Anspruch und sollte sorgfältig durchgeführt werden.
      3. Die Schritte 3.2.3.1 bis 3.2.3.2 2x für insgesamt drei Wäschen wiederholen, es sei denn, es wird eine Größenausschlusschromatographie durchgeführt (in diesem Fall genügt ein Zentrifugationsschritt). Letztendlich resuspendieren Sie das Pellet auf eine gewünschte Konzentration (z. B. 5,55 mg/ml Gesamtlipid), indem Sie ein angemessenes Volumen Puffer N hinzufügen.
        STOPPPUNKT: Die Proteoliposomen können sofort verwendet oder mindestens 48 h bei 4 °C gelagert werden. Die Größe der Ultrazentrifugationsröhrchen sollte auf der Grundlage der Probengröße gewählt werden. Für ein Pellet mit 6,66 mg Gesamtlipiden ist ein 6,5-ml-Röhrchen geeignet. Das Waschen von 200 μl Proteoliposomen (insgesamt 33,33 mg Lipide/ml; Trockenpelletvolumen ~40 μl)28 für 3 x 6 mL Puffer verdünnt die externen Komponenten für jeden Waschschritt um den Faktor 100. Wenn Tuben unterschiedlicher Größe verwendet werden, ist es wünschenswert, die Anzahl der Wäschen entsprechend anzupassen.
  3. Tag 3
    1. Nachweis der ATP-Synthese durch Fluoreszenz
      1. Mischen Sie die Reaktionskomponenten zu einem Endvolumen von 120 μl (Tabelle 3) in einer schwarzen Quarzküvette mit einem Fenster von 3 x 5 mm und einem minimalen Innenvolumen von 100 μl.
        HINWEIS: Ionophore können hinzugefügt werden, um elektrochemische Ionengradienten zu dissipieren. Ein Gemisch aus Valinomycin und Nigericin (je 1 μM) löst effektiv alle Protonen- und Kaliumgradienten auf.
      2. Die Probe wird in einem auf 30 °C eingestellten Fluorometer vorgewärmt und Anregungsspektren von PercevalHR aufgenommen (Anregung 400-520 nm, Bandbreite 5 nm; Emission 550 nm, Bandbreite 5 nm). Sobald das Sondensignal konstant ist, wird das metabolische Netzwerk durch Zugabe eines Überschusses an L-Arginin (5-10 mM) und Glycerin (400 μM) gestartet, wenn das Recycling von ATP an die Synthese von Glycerin-3-phosphat gekoppelt ist. Verfolgen Sie die Reaktion im Laufe der Zeit.
    2. Datenanalyse
      1. Plotten Sie das Verhältnis F500/F430 als Funktion der Zeit, das ein qualitativer Indikator für das ATP/ADP-Verhältnis ist. Für eine quantitativere Beurteilung der ATP-Bildung kann eine Kalibrierungskurve in Proteoliposomen erstellt werden oder ein komplementärer Ansatz verwendet werden (z. B. ATP-Quantifizierung durch Chemilumineszenz28).
Bestandteil Endkonzentration
Puffer A 50 mM KPi pH 7,0
DVB-T 2 mM
Na-ADP ca. 10 mM
MgCl2 ca. 10 mM
L-Ornithin 0,5 Mio. m
Fluoreszierende Sonde (PercevalHR oder Pyranin) 5,8 μM bzw. 0,1 mM
ArcA (Arginin Deiminase) 1 μM
ArcB (Ornithin-Carbamoyltransferase) 2 μM
ArcC1 (Carbamat-Kinase) 5 μM
GlpK (Glycerinkinase) 1,6 μM
Proteoliposomen 33,33 mg/ml Gesamtlipide

Tabelle 2: Verkapselungskomponenten. Die Komponenten werden in der Reihenfolge ihrer Addition aufgelistet. Lösliche Proteine befinden sich in Puffer E; alle anderen Komponenten (außer MgCl2 in deionisiertem Wasser) befinden sich in Puffer A.

Bestandteil Endkonzentration
Puffer K 50 mM KPi pH 7,0, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0
Proteoliposomen (5,55 mg/ml Lipide) 2,7 mg/ml Lipide
Ionophore (Valinomycin, Nigericin) je 1 μM

Tabelle 3: Experimentelle Bedingungen. Die Komponenten werden in der Reihenfolge ihrer Addition aufgelistet. Proteoliposomen befinden sich in Puffer N, Ionophore in DMSO oder EtOH.

4. Upscaling eines metabolischen Netzwerks für mikrometergroße Vesikel

  1. Tag 1
    1. Mikrofluidische Chipvorbereitung
      HINWEIS: In diesem Experiment wird ein mikrofluidisches Gerät verwendet, das von Robinson et al.34 entwickelt wurde. Andere Designs von mikrofluidischen Chips sind verfügbar 35,36,37 und können in diesem Protokoll leicht implementiert werden.
      1. Schneiden Sie eine 200-μl-Pipettenspitze ein Drittel von der Unterseite ab und führen Sie den unteren Teil der Spitze in eine vorgefertigte mikrofluidische Auffangvorrichtung ein.
      2. In das Einlassreservoir des Chips werden 400 μl β-Kaseinlösung (2 mg/ml; siehe Schritt 1.5) gegeben, wobei darauf zu achten ist, dass bei diesem Schritt keine Luft eingebracht wird. Stellen Sie einen 96-Well-Platteneimer auf und geben Sie ein Laborgewebe in eine konische Tischröhrchenzentrifuge. Legen Sie den Chip auf das Gewebe und zentrifugieren Sie ihn 6 Minuten lang bei 900 × g , um die Passivierung des mikrofluidischen Chips zu ermöglichen. Nach dem Zentrifugationsschritt sollte der Flüssigkeitsstand am Einlassbehälter und an der Auslassspitze des mikrofluidischen Chips gleich sein. Überprüfen Sie, ob der Chip undicht ist. Inkubieren Sie die β-Kasein-Lösung mindestens 30 Minuten lang im Mikrofluidik-Chip.
      3. Entfernen Sie den größten Teil der Passivierungslösung, ohne Luft hinzuzufügen, und fügen Sie 400 μl Waschpuffer (Puffer P) hinzu. Legen Sie den Chip auf den 96-Well-Platteneimer und zentrifugieren Sie ihn 6 Minuten lang bei 900 × g . Lassen Sie den Chip bis zum Gebrauch in der Waschlösung (maximal 4 Stunden lang).
  2. Gelpräparation für die Herstellung von Proteo-GUVs
    HINWEIS: Die folgende Beschreibung wurde von25,38 übernommen und angepasst.
    1. 0,5 % (w/w) einer Agarose mit niedriger Geliertemperatur (LGT) werden in deionisiertem Wasser gelöst, indem die Lösung in der Mikrowelle erhitzt wird; Stellen Sie sicher, dass sich die Agarose vollständig aufgelöst hat und vermeiden Sie es, die Lösung zu kochen. Bewahren Sie die Agarose bis zur weiteren Verwendung bei 50 °C auf.
      HINWEIS: Gelöste Agarose kann mehrere Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden. Um die Agarose wiederzuverwenden, schmelzen Sie das Gel einfach in der Mikrowelle.
    2. Nehmen Sie zwei Objektivfolien und zeichnen Sie den Umriss des Abstandshalters auf die Folien. Machen Sie die Objektträger hydrophil durch Plasmareinigung mit Plasma mit hohem Sauerstoffgehalt für 1 min.
    3. Geben Sie LGT Agarose auf den Objektträger, bis er vollständig mit Agarose (~500 μL) bedeckt ist; Kippen Sie dann den Objektträger in einem Winkel von 90° und lassen Sie überschüssige Agarose auf ein Taschentuch abtropfen. Lassen Sie die Objektträger 30 min bei 50 °C ruhen.
    4. In flüssigem Stickstoff gelagerte Proteoliposomen (Abschnitt 3) entnehmen und auf Eis auftauen. Verdünnen Sie die Vesikel mit Puffer Q auf 5 mg/ml Lipide.
      HINWEIS: Die in Abschnitt 3 hergestellten Proteoliposomen enthalten keine löslichen Proteine und können weit im Voraus hergestellt werden, wenn sie in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Achten Sie bei der Arbeit mit proteoGUVs darauf, die Arbeitslösungen immer zu filtern, um ein Verstopfen des mikrofluidischen Geräts zu vermeiden.
    5. Beschallung der Proteo-Liposomen mit einem tragbaren Sonden-Ultraschallgerät mit einer 1-mm-Sonde. Beschallung für 10 Zyklen von 0,5 s an und 0,5 s aus bei 70 % Amplitude. Halten Sie die Vesikel, im Folgenden als ProteoSUVs bezeichnet, 30 s lang auf Eis und wiederholen Sie den Ultraschallprozess 5x.
    6. Füllen Sie eine 100-μl-Spritze (in einem tragbaren LCP-Dispenser) mit der proteo-SUV-Suspension. 0,5 μl Tröpfchen von Proteo-SUVs auf das zuvor vorbereitete Agarosegel ablegen; Achten Sie darauf, die Agaroseschicht nicht zu stören und genügend Abstand zu halten, um ein Verschmelzen von Tröpfchen zu verhindern.
      HINWEIS Die Verwendung eines tragbaren LCP-Dispensers ermöglicht eine reproduzierbare Tröpfchenabscheidung, aber es können auch alternative Pipettiersysteme verwendet werden. Die Schmierblutung mit einer Glaskapillare ist weniger geeignet, da sie das getrocknete Agarosegel stört.
    7. Trocknen Sie die SUV-Tröpfchen in ~10 Minuten mit einem Stickstoffstrom anstelle von Druckluft, um die Möglichkeit einer Oxidation der Lipide zu verringern.
    8. 1 ml eines 1,25x konzentrierten Puffers O (Tabelle 4) in Puffer A vorbereiten und durch einen 0,2 μm Celluloseacetatfilter passieren. Nehmen Sie 800 μl der 1,25-fach konzentrierten Lösung und fügen Sie die löslichen Enzyme und Sonden bis zu einer in Tabelle 4 angegebenen Konzentration hinzu. Verwenden Sie gefiltertes deionisiertes Wasser, um das Endvolumen auf 1 ml zu erhöhen.
    9. Bereiten Sie 100 μl Quelllösung vor, die alle Bestandteile der Tabelle 4 mit Ausnahme von Proteinen und Glycerin enthält. Messen Sie die Osmolalität der Quelllösung mit einem kalibrierten 3-Punkt-Gefrierpunktosmometer.
      HINWEIS: Bereiten Sie 100 μl Quelllösung ohne Protein und Glycerin vor, um die Osmolalität dieser Lösung genau zu bestimmen. Glycerin, das in der Proteinlösung vorhanden ist, beeinflusst die Osmolalität, aber in GUVs diffundiert Glycerin schnell durch die Membran und führt nur zu vorübergehenden osmotischen Unterschieden.
    10. Bauen Sie die GUV-Quellkammer zusammen, indem Sie ein Sandwich aus zwei Objektivgläsern mit dem Gel und getrockneten SUVs mit einem 1,5 oder 3,0 mm dicken Teflon-Abstandshalter dazwischen herstellen. Geben Sie dann die Quelllösung mit einer Spritze und einer Nadel durch das kleine Loch in der Seite in die Kammer.
      HINWEIS: Das Volumen der Quelllösung kann durch Variieren der Abstandshalter von 1,5 bis 3,0 mm eingestellt werden.
  3. Aufblähung von Vesikeln und Entnahme von GUVs
    1. Lassen Sie das Aufquellen der Vesikel zu, indem Sie die Kammer mindestens 30 Minuten lang auf 22 °C stellen.
      HINWEIS: Die Schwellung der Vesikel kann durch Lichtmikroskopie (z. B. ein Tisch-Phasenkontrastmikroskop oder ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop) verfolgt werden, wenn die Proteine oder Lipide fluoreszenzmarkiert sind.
    2. Ernten Sie die GUVs aus dem Gel, indem Sie die Kammer sanft physikalisch bewegen, indem Sie die Kammer auf eine feste Oberfläche (z. B. Labortisch) klopfen; Nehmen Sie ein Drittel des Volumens heraus und verwenden Sie die resultierende Luftblase, um die verbleibende Flüssigkeit sanft in Bewegung zu bringen, wodurch sich die GUVs vom Gel lösen.
    3. Während die GUVs quellen, bereiten Sie den Puffer P vor und passen Sie die Osmolalität an die Quelllösung an, indem Sie die Glukosekonzentration anpassen. Den Puffer durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter filtrieren.
      HINWEIS: Im Allgemeinen sollte die Wasch- und Substratlösung innerhalb von ± 5 mosmol/kg gehalten werden. Jede Lösung, die durch den Chip fließt, sollte sehr sauber sein, da Verunreinigungen die Kanäle verstopfen können. Stellen Sie jedes Mal frische Puffer her oder lagern Sie die vorbereiteten Puffer bei -20 °C und filtern Sie sie vor der Verwendung.
  4. Einfangen der GUVs für Mikroskopie-Experimente
    1. Montieren Sie den passivierten Mikrofluidik-Chip auf dem Probentisch des Mikroskops. Auf mögliche Defekte prüfen (z. B. Undichtigkeiten, Lufteingeschlossenheit, verstopfte Kanäle).
      HINWEIS: Die Überprüfung des Chips kann lange vor der Verwendung erfolgen, damit bei Bedarf ein neuer Chip vorbereitet werden kann.
    2. Verbinden Sie den Schlauch mit einer gebogenen Nadel mit dem Auslass des Reservoirs und verbinden Sie das andere Ende mit einer 1-ml-Spritze. Montieren Sie die Spritze an einer Pumpe und stellen Sie die Durchflussrate auf maximal 10 μl/min ein.
    3. Den Waschpuffer aus dem Behälter nehmen (Schritt 4.1.1.3) und durch frisches Medium (Puffer P) ersetzen. Starten Sie den Pufferfluss durch den Chip, indem Sie über die Spritze bei 1-10 μl/min infundieren. Mit mindestens 80 μl osmotisch ausgeglichenem Waschpuffer (Puffer P) waschen.
    4. Entfernen Sie überschüssigen Waschpuffer aus dem Reservoir und geben Sie die (Proteo)GUVs in das Reservoir. Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,1 bis 1 μl/min ein, damit die GUVs durch den Chip fließen können. Überwachen Sie den Chip im Laufe der Zeit, bis genügend GUVs im Chip eingeschlossen sind.
      HINWEIS: Vesikel mit relativ großen Mengen (>20 mol%) an geladenen Lipiden wie Phosphatidylglycerin (PG), Phosphatidylserin (PS) oder Phosphatidsäure (PA) oder nicht doppelschichtbildenden Lipiden wie Phosphatidylethanolamin (PE) werden mit einer geringeren Flussrate durch den Chip eingeführt, um ein Platzen zu verhindern. Vesikel, die aus reinem Phosphatidylcholin (PC) bestehen, sind tendenziell stabiler.
    5. Entfernen Sie überschüssige GUV-Lösung und fügen Sie den Waschpuffer P mit einem konstanten Fluss von 0,1-1 μl/min hinzu, um das externe Medium auszutauschen, und waschen Sie die eingeschlossenen GUVs mindestens 1 h lang, um nicht verkapselte Verbindungen zu entfernen und die Hintergrundfluoreszenz zu verringern, wenn ein Fluorophor verkapselt ist. Überwachen Sie die Hintergrundfluoreszenz im Laufe der Zeit; Wenn die Hintergrundfluoreszenz nicht abnimmt, kann der Chip blockiert sein.
    6. Lokalisieren Sie Fallen mit ausreichenden Mengen an Vesikeln und speichern Sie deren Positionen. Wenden Sie die Einstellungen am Mikroskop an (z. B. Laserintensität, Verstärkung, Wellenlänge) und starten Sie ein Zeitreihenexperiment.
    7. Geben Sie osmotisch ausgeglichene Substratlösung (Puffer R) in das Reservoir und starten Sie eine Durchflussrate von 0,5 μL/min.

Komponenten von Buffer L
Bestandteil 1,25 x Konzentration Arbeitskonzentration
Puffer A 62,5 mM KPi pH 7,0 50 mM KPi pH 7,0
Saccharose 125 mM ca. 100 mM
DVB-T 2,5 Mio. M. 2 mM
Na-ADP 12,5 Mio. M. ca. 10 mM
MgCl2 12,5 Mio. M. ca. 10 mM
L-Ornithin 0,625 mM 0,5 Mio. m
Komponenten für die Verkapselung
Pyranin oder PercevalHR 1 mM oder 20 μM
ArcA (Arginin Deiminase) 1 μM
ArcB (Ornithin-Carbamoyltransferase) 2 μM
ArcC1 (Carbamat-Kinase) 5 μM

Tabelle 4: Puffer O und Verkapselungskomponenten. Die Komponenten werden in der Reihenfolge ihrer Addition aufgelistet. Alle Komponenten (mit Ausnahme von MgCl2 in deionisiertem Wasser) befinden sich in Puffer A. Die Verkapselungskomponenten sind in der Reihenfolge ihrer Zugabe aufgeführt. Alle wasserlöslichen Proteine befinden sich in Puffer E.

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Representative Results

Die Rekonstitution von solubilisierten Membranproteinen in Liposomen erfordert die Destabilisierung von vorgeformten Vesikel. Die Zugabe geringer Mengen an Triton X-100 führt zunächst zu einer Erhöhung der Absorption bei 540 nm (A540) aufgrund einer Zunahme der Lichtstreuung durch die Schwellung der Vesikel (Abbildung 4). Der maximaleA-540-Wert ist der Punkt, an dem die Liposomen mit Detergens (Rsat) gesättigt sind, wonach jede weitere Zugabe von Triton X-100 zu einer teilweisen Solubilisierung der Vesikel führt. Bei Rsol sind die Liposomen vollständig solubilisiert (Abbildung 4). Für die Rekonstitution von Membranproteinen verwenden wir typischerweise Vesikel, die zu 60% über Rsat destabilisiert sind (durch Pfeil gekennzeichnet).

Das rekonstituierte Membranprotein ArcD wird für den Transport von L-Arginin in die Vesikel und L-Ornithin aus den Vesikeln verwendet und wird zusammen mit den verkapselten Enzymen ArcA, ArcB und ArcC verwendet, um ATP aus ADP und anorganischem Phosphat zu recyceln. GlpT ist ein Glycerin-3-phosphat/Phosphat-Antiporter, der zusammen mit GlpK für die Synthese (und Ausscheidung) von Glycerin-3-phosphat aus Glycerin plus ATP benötigt wird, das durch den L-Arginin-Abbau produziert wird. Die Zugabe von 5 mM L-Arginin bei t = 0 zu den Proteoliposomen führt zu einem steilen Anstieg des Verhältnisses der PercevalHR-Fluoreszenz bei 500 nm und 430 nm Anregung39, was das ATP/ADP-Verhältnis innerhalb der Vesikel widerspiegelt (Abbildung 5). Bei Zugabe von Glycerin wird das ATP für die Synthese von Glycerin-3-phosphat verwendet, was zu einer Absenkung des ATP/ADP-Verhältnissesführt 28. Der Abbau von L-Arginin führt auch zu pH-Veränderungen, die mit Pyranin oder pHluorin quantifiziert werden können27.

Figure 5
Abbildung 5: Recycling von ATP über den L-Arginin-Abbauweg. LUVs mit 2,7 mg Lipid/ml werden in eine Küvette gegeben und das Fluoreszenzverhältnis bei 500 nm und 430 nm aufgezeichnet. 5 mM L-Arginin werden bei t = 0 zugegeben. Das F500/F430-Verhältnis ist ein Maß für das ATP/ADP-Verhältnis in den Vesikel. Abkürzung: LUVs = groß-unilamelläre Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die ATP-produzierenden LUVs können auch zur Bildung von GUVs verwendet werden. Die Rehydrierung von getrockneten Proteo-LUVs auf einem LGT Agarosegel führt zur Bildung von mikrometergroßen Vesikeln (Abbildung 6). Die Bildung von Proteo-GUVs innerhalb der getrockneten LUV-Spots hängt stark von der lokalen Konzentration der Lipide und dem Grad der Dehydratisierung ab. In einigen Gebieten gibt es große Flecken von GUVs, während an anderen Stellen im selben Tröpfchen keine oder nur wenige GUVs gebildet werden können. Die Bildung von GUVs über die LGT-Agarose-unterstützte Quellung führt zu einer Reihe von GUV-Größen, typischerweise von wenigen Mikrometern bis zu mehr als 50 μm.

Figure 6
Abbildung 6: DIC-Bilder von ProteoGUVs, die durch gelgestützte Schwellung gebildet werden. Maßstabsleiste = 25 μm. Abkürzungen: DIC = differentieller Interferenzkontrast; GUVs = riesig-unilammellares Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die GUVs werden geerntet und in einem β-Kasein-passivierten PDMS-basierten mikrofluidischen Gerät gefangen (Abbildung 7). Das Gerät ist so konzipiert, dass viele Vesikel in einem einzigen Experiment gefangen und analysiert werden können, und das Gerät wird zur Steuerung der externen Umgebung (Flussrate, Pufferzusammensetzung usw.) verwendet. 34. Selbst wenn die Ausbeute an Proteo-GUVs gering ist, können durch den konstanten Fluss von GUVs durch den mikrofluidischen Chip viele Vesikel gesammelt werden. Sobald genügend GUVs gefangen sind, wird das System mit einem osmotisch ausgeglichenen Puffer gewaschen, um externe Komponenten wie lösliche Proteine, kleine Moleküle und Fluoreszenzsonden zu entfernen. Der Waschpuffer wird dann durch eine Substratlösung gleicher Osmolalität ersetzt, die 50 mM KPi (pH 7,0), unterschiedliche Mengen an Glukose (zur Einstellung der Osmolalität) und Substrate wie 10 mM L-Arginin enthält. Es wird ein Zeitreihenexperiment an mehreren Traps des Mikrofluidik-Chips durchgeführt und alle 90 s Bilder aufgenommen (405 nm und 488 nm Anregung bei Verwendung von PercevalHR). Weiterhin wird zu jedem Zeitpunkt ein Hellfeldbild aufgenommen. Das Verhältnis der Emissionsintensitäten nach Anregung bei 488 und 405 nm ist ein Maß für das ADP/ATP-Verhältnis in den Vesikel.

Figure 7
Abbildung 7: Einfangen von Vesikeln mit dem Mikrofluidik-Chip. (A) Einfangen der Vesikel, begleitet von der Fähigkeit, die äußere Umgebung und die Flussrate zu kontrollieren. (B) ProteoGUVs, die in einem mikrofluidischen Gerät gefangen sind und mit einem 405-nm-Laser (grün) und einem 488-nm-Laser (rot) angeregt werden. Die Emission für beide Kanäle wird bei >500 nm gemessen. Das Hellfeldbild ermöglicht die Visualisierung der Vesikel ohne Fluoreszenz. Maßstabsleiste = 25 μm. Abkürzung: GUVs = riesen-unilamelläre Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Wir stellen ein Protokoll für die Synthese von (Membran-)Proteinen vor, die submikrometergroße Lipidvesikel (proteoLUVs) enthalten, und die Umwandlung von proteoLUVs in riesen-unilamelläre Vesikel (proteoGUVs). Das Protokoll sollte anwendbar sein für die Rekonstitution anderer Membranproteine13, 19, 30, 40 und die Verkapselung anderer Stoffwechselnetzwerke als der hier vorgestellten L-Arginin-Abbau- und Glycerin-3-phosphat-Synthesewege.

Die Rekonstitution von Membranproteinen in Liposomen führt in der Regel zu einer zufälligen Orientierung der Proteine innerhalb der Lipidmembran. Für ArcD und Glpt spielt die Orientierung keine Rolle, da die Proteine bidirektional arbeiten und sich die gelösten Stoffe in Abhängigkeit vom Vorzeichen des gesamten elektrochemischen Potentials bewegen. Bei Proteinen, die in eine Richtung funktionieren, steht die Hälfte der Moleküle nicht für die Aktivität zur Verfügung, wenn ihre Ausrichtung 50/50 ist.

Die Extrusion von Vesikeln durch einen Polycarbonat-Filter verengt die Größenverteilung, und die Vesikel werden umso homogener, je kleiner die Porengröße der Filter ist. Kleinere Vesikel haben jedoch den Preis, dass sie ein kleineres Volumen und damit eine sehr geringe Anzahl von Proteinen (Enzyme, Membranproteine) pro Vesikel haben. Um den Anteil von LUVs zu minimieren, bei denen eine oder mehrere Komponenten fehlen, kann die Konzentration der Proteine wie in Abbildung 3A,B gezeigt angepasst werden, aber bei sehr kleinen Vesikeln sind stochastische Effekte unvermeidlich.

Das gelgestützte Quellverfahren beruht auf der Abscheidung von beschallten Vesikeln (SUVs) auf einer getrockneten Agaroseoberfläche. Während des Trocknungsprozesses bildet sich ein Konzentrationsgradient der Vesikel und die Lipidkonzentration ist an der Peripherie des Spots am höchsten. Dies ist auf ein Phänomen zurückzuführen, das als Kaffeefleckeneffekt bekannt ist41,42. Dies hat zur Folge, dass nur ein kleiner Bereich innerhalb des Spots eine Konzentration an Lipiden enthält, die für die GUV-Bildung geeignet sind. Kreisförmige, ungleichmäßig konzentrierte Lipidflecken führen zu großen ungenutzten Flächen, die für die Vesikelfusion nicht zur Verfügung stehen. Daher wird die Effizienz der GUV-Bildung bei diesem Ansatz gering. Um die Ausbeute an GUVs zu erhöhen, sollte eine gleichmäßige Lipidabscheidung angestrebt werden, die durch Schleuderbeschichtung42 oder Nutzung des Kaffeefleckeneffekts41 erreicht werden kann.

Weitere Hinweise zum Protokoll:

Es sollte darauf geachtet werden, dass mehrere Membranproteine (>10) durchschnittlich pro Vesikel rekonstituiert werden, um stochastische Effekte zu vermeiden. Vermeiden Sie daher Lipid-Protein-Verhältnisse von mehr als 400:1 w/w. Für die meisten Proteine wird eine zufällige Orientierung angenommen.

Im Idealfall ist das Volumen der Gesamtmembranproteine so klein wie möglich und überschreitet sowieso nicht 10-20% des Liposomenvolumens. Durch die Zugabe größerer Volumina wird mehr Waschmittel eingebracht und die Mehrheit der vorgeformten Liposomen kann lysieren, was sich negativ auf die Rekonstitutionseffizienz auswirken kann.

Die Voräquilibrierung des Extruders mit der entsprechenden Lösung ist wichtig, um eine Verdünnung der Komponenten während der Verkapselung zu vermeiden. Im Idealfall sollte die Voräquilibrierungslösung auch die löslichen Enzyme enthalten, aber die Einbeziehung von Enzymen kann aufgrund des relativ großen Volumens, das für die Voräquilibrierung des Extruders benötigt wird, zu kostspielig sein. Daher lassen wir diese Komponenten in der Regel weg und akzeptieren eine 5%ige Verdünnung der Enzyme.

Den Gemischen, die Proteoliposomen enthalten, sollten Ionophore zugesetzt werden, da die Moleküle stark hydrophob sind und an Oberflächen adsorbieren können, wenn keine Vesikel vorhanden sind. Es ist darauf zu achten, dass das zugegebene Lösungsmittelvolumen gering ist (<1 % des gesamten Reaktionsvolumens). Es werden Kontrollen durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Lösungsmittel die Stoffwechselnetzwerke in den Vesikeln nicht beeinflussen. Ionophorkonzentrationen von etwa 1 μM sind im Allgemeinen sicher für Gesamtlipidkonzentrationen von ~3 mg/ml.

Es sollte darauf geachtet werden, dass die Tröpfchen gründlich getrocknet werden. Wenn die Tröpfchen nicht trocken genug sind, ist die GUV-Bildung weniger effizient, da Lipide Lipidaggregate bilden und sich MLVs bilden können, wenn die Quelllösung hinzugefügt wird.

Glukose wird verwendet, um die Osmolarität des äußeren mit dem inneren Medium abzugleichen; Letzteres enthält Saccharose anstelle von Glukose, um die Dichte der Vesikel zu erhöhen und dadurch die Sedimentation der GUVs zu erleichtern. Darüber hinaus erhöht Glukose in der äußeren Umgebung den Phasenkontrast, wodurch das Vesikel leichter sichtbar wird.

Stochastische Effekte sind bei GUVs viel weniger ein Problem; Hier kann das Oberflächen-Volumen-Verhältnis jedoch inakzeptabel niedrig werden, so dass die Anzahl der Membranproteine (z. B. Transporter) für das interne Stoffwechselnetzwerk limitierend wird. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode erlaubt keine genaue Kontrolle über die Größe der ProteoGUVs, aber die Mehrzahl fällt in den Größenbereich von 5-50 μm.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellte Arbeit einen umfassenden Überblick über die Rekonstitution von Membranproteinen und die Enzymverkapselung in Lipidvesikeln unterschiedlicher Größe bietet. Wir demonstrieren den Aufbau von funktionellen Vesikeln für die Synthese von ATP und Bausteinen aus einfachen Vorläufern wie Aminosäuren und Glycerin. Die Rekonstitution von Membranproteinen in GUVs bleibt eine Herausforderung, aber die hier vorgestellten Protokolle ebnen den Weg für weitere Entwicklungen in der Bottom-up-Forschung in der synthetischen Biologie.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Acknowledgments

Die Autoren danken Aditya Iyer für die Klonierung des pBAD-PercevalHR-Gens und Gea Schuurman-Wolters für die Unterstützung bei der Proteinproduktion und -reinigung. Die Forschung wurde durch das NWO-Gravitationsprogramm "Building a Synthetic Cell" (BaSyC) gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Aldrich A9414-25g
Amicon cut-off filter Sigma Aldrich Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra 
BioBeads BioRad 152-3920
CHCl3 Macron Fine Chemicals MFCD00000826
D(+)-Glucose Formedium -
D(+)-Sucrose Formedium -
DDM Glycon D97002 -C
Diethyl Ether Biosolve 52805
DMSO Sigma-Aldrich 276855-100ml
DOPC Avanti 850375P-1g
DOPE Avanti 850725P-1g
DOPG Avanti 840475P-1g
DTT Formedium  DTT005
EtOH J.T.Baker Avantor MFCD00003568
Extruder Avestin Inc LF-1
Fluorimeter Jasco Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol BOOM 51171608
Gravity flow column Bio-Rad 732-1010
Hamilton syringe 100 µL Hamilton 7656-01
Hamilton syringe 1000 µL Hamilton 81320
Handheld LCP dispenser Art Robbins Instruments 620-411-00
Handheld Sonicator Hielscher Ultrasound Technology UP50H
HCl BOOM x76021889.1000
Imidazole Roth X998.4-250g
K2HPO4 Supelco 1.05099.1000
KCl BOOM 76028270.1
KH2PO4 Supelco 1.04873.1000
Kimwipe Kimtech Science 7552
Large Falcon tube centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006-100G
Light microscope Leica DM LS2
L-Ornithine Roth T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670-1KG
Microfluidic chip Homemade  PDMS based DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP Sigma-Aldrich A2754-1G
NaCl Supelco 1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer Isogen Life Science ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH Supelco 1.06498.1000
Needles for GUVs Henke-Ject 14-14575 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics Henke-Ject 14-15538 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose Cytiva 17526802
Nigericin Sigma-Aldrich N7143-5MG
Nutator VWR 83007-210
Osmolality meter Gonotec Salmenkipp Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner Plasma Etch PE-Avenger
Polycarbonate filter Cytiva Whatman Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 355647
Pyranine Acros Organics H1529-1G
Quartz cuvette (black) Hellma Analytics 108B-10-40
Sephadex G-75 resin  GE Healthcare 17-0050-01
Sonicator Sonics Sonics & Materials INC Sonics vibra cell
Syringe filter Sarstedt Filtropur S plus 0.2 0.2 µm
Syringe pump Harvard Apparatus A-42467
Tabletop centrifuge Eppendorf centrifuge 5418
Teflon spacer Homemade  Teflon based 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris PanReac AppliChem A1086.1000
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100 ml
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima Max-E
UV lamp Spectroline ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer Jasco V730 spectrophotometer
Valinomycin Sigma-Aldrich V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope Zeiss AxioObserver
β-Casein Sigma Aldrich C5890-500g

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References

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Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, B. Construction of Out-of-Equilibrium Metabolic Networks in Nano- and Micrometer-Sized Vesicles. J. Vis. Exp. (206), e66627, doi:10.3791/66627 (2024).

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