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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

在纳米和微米大小的囊泡中构建失衡代谢网络

Published: April 12, 2024 doi: 10.3791/66627
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Groningen

Summary

我们提出了一种用于在亚微米和微米大小的脂质囊泡中重建膜蛋白并将酶和其他水溶性成分封装的方案。

Abstract

我们提出了一种将复杂的蛋白质网络掺入囊泡的方法，该网络涉及整合的膜蛋白、酶和基于荧光的传感器，使用纯化的组分。该方法对于生物反应器的设计和构建以及复杂失衡代谢反应网络的研究具有重要意义。我们首先根据先前开发的方案将（多个）膜蛋白重构为大的单层囊泡 （LUV）。然后，我们通过冻融挤出封装纯化的酶、代谢物和基于荧光的传感器（荧光蛋白或染料）的混合物，并通过离心和/或尺寸排阻色谱法去除未掺入的组分。通过监测 ATP/ADP 比率、代谢物浓度、内部 pH 值或其他荧光读数参数，实时测量代谢网络的性能。我们直径为 100-400 nm 的含膜蛋白囊泡可以使用现有但优化的程序转化为巨单层囊泡 （GUV）。该方法能够将可溶性成分（酶、代谢物、传感器）包含在微米大小的囊泡中，从而将生物反应器的体积增加几个数量级。含有GUV的代谢网络被捕获在微流体装置中，通过光学显微镜进行分析。

Introduction

自下而上的合成生物学领域侧重于构建（最小）细胞 1,2 和用于生物技术 3,4 或生物医学目的的代谢生物反应器 5,6,7,8。合成细胞的构建提供了一个独特的平台，使研究人员能够在模仿天然环境的明确条件下研究（膜）蛋白质，从而能够发现蛋白质和反应网络的涌现特性和隐藏的生化功能9。作为迈向自主功能合成细胞的中间步骤，开发的模块可以捕获活细胞的基本特征，例如代谢能量守恒、蛋白质和脂质合成以及体内平衡。这些模块不仅增强了我们对生命的理解，而且在医学8和生物技术10领域也有潜在的应用。

跨膜蛋白几乎是任何代谢网络的核心，因为它们将分子运入或运出细胞、发出信号并对环境质量做出反应，并发挥许多生物合成作用。因此，在大多数情况下，合成细胞中代谢模块的工程需要将整合和/或外周膜蛋白重组为由特定脂质和高完整性（低渗透性）组成的膜双层。这些膜蛋白的处理具有挑战性，需要特定的知识和实验技能。

已经开发了几种方法来重建磷脂囊泡内的膜蛋白，最常见的目的是研究特定蛋白质的功能11,12、调节13、动力学特性14,15、脂质依赖性15,16 和/或稳定性17。这些方法包括在脂质存在下将洗涤剂溶解的蛋白质快速稀释到水性介质中18，通过将洗涤剂溶解的蛋白质与洗涤剂不稳定的脂质囊泡孵育来去除洗涤剂，并将洗涤剂吸收到聚苯乙烯珠19 上，或通过透析或尺寸排阻色谱法 20 去除洗涤剂20.有机溶剂已被用于形成脂质囊泡，例如，通过形成油水界面相21，但是当暴露于此类溶剂时，大多数整合膜蛋白会失活。

在我们的实验室中，我们主要通过洗涤剂吸收法重组膜蛋白以形成大单层囊泡 （LUV）19。该方法允许多种膜蛋白的共重组以及酶、代谢物和探针在囊泡腔中的包封22,23。含有膜蛋白的 LUV 可以在有/不包封水溶性成分的情况下转化为巨单层囊泡 （GUV），使用电形成24 或凝胶辅助溶胀25 和特定条件来保持膜蛋白的完整性26。

本文提出了一种在LUV中重建失衡代谢网络的方案，该网络通过将L-精氨酸分解成L-鸟氨酸27来再生ATP。ATP 的形成与甘油-3-磷酸 （G3P） 的产生偶联，甘油-3-磷酸是磷脂合成的重要组成部分22,28。代谢途径由两种完整的膜蛋白组成，即精氨酸/鸟氨酸 （ArcD） 和 G3P/Pi 逆向转运蛋白 （GlpT）。此外，ATP的循环需要三种可溶性酶（ArcA、ArcB、ArcC），GlpK用于将甘油转化为3-磷酸甘油，利用来自L-精氨酸分解的ATP，见图1了解该途径的示意图。该协议为未来构建更复杂的反应网络（用于脂质或蛋白质的合成或细胞分裂）提供了一个良好的起点。囊泡的脂质组成支持多种整合膜蛋白的活性，并且已针对不同分子进出囊泡的转运进行了优化 27,29,30。

Figure 1
图 1：ATP 产生和甘油 3-磷酸合成和排泄的途径概述。 请点击这里查看此图的较大版本.

简而言之，将纯化的膜蛋白（溶解在十二烷基-β-D-麦芽糖苷，DDM）中加入到已用Triton X-100不稳定的预形成的脂质囊泡中，该脂质囊泡允许将蛋白质插入膜中。洗涤剂分子随后通过添加活化的聚苯乙烯珠子（缓慢）去除，从而形成密封良好的蛋白脂质体。然后可以将可溶性成分添加到囊泡中，并通过冻融循环进行封装，从而在膜融合过程中捕获分子。获得的囊泡是高度异质的，许多是多层状的。然后，它们通过孔径为 400、200 或 100 nm 的聚碳酸酯过滤器挤出，从而产生尺寸更均匀的囊泡;孔径越小，囊泡越均匀和单层状，但代价是内部体积较小。通过体积排阻色谱法从外部溶液中去除未掺入的蛋白质和小分子。proteoLUVs可以通过凝胶辅助溶胀转化为微米大小的囊泡，然后这些proteoGUVs被收集并捕获在微流控芯片中，用于显微表征和操作。 图 2 显示了完整协议的示意图概述。

Figure 2
图 2：在亚微米 （LUV） 和微米尺寸 （GUV） 的脂质囊泡中重建膜蛋白和封装酶和水溶性成分的方案概述。 请点击这里查看此图的较大版本.

重组和包封方案效果良好，保留了蛋白质的功能，但 proteoLUV 和 proteoGUV 的大小是异质的。微流体方法31,32 允许形成微米大小的囊泡，这些囊泡的大小更均匀，但膜蛋白的功能重建通常是不可能的，因为双层中的残留溶剂会使蛋白质失活。proteoLUV 的大小范围为 100 至 400 nm，在低浓度的酶下，包封可能导致具有不完整代谢途径的囊泡（随机效应;见图 3）。LUV 是构建特定代谢模块的理想选择，如图所示，用于生产 ATP 和 G3P 等构建块。这种蛋白 LUV 有可能被包裹在 GUV 中，并作为宿主囊泡的细胞器样隔室。

Figure 3
图 3：直径为 100、200 或 400 nm 的每个囊泡的分子数。 （A） 当包封的蛋白质（酶、探针）在 1-10 μM 的范围内时。 （B） 重构在每脂质 1 至 1,000、1 至 10,000 和 1 至 100,000 个膜蛋白 （mol/mol） 时进行。我们假设分子在指示的浓度下被封装，并以这些蛋白质与脂质的比例掺入膜中。对于一些酶，我们已经看到它们与膜结合，这可以增加它们在囊泡中的表观浓度。缩写： LPR = 脂质-蛋白质比率 请点击这里查看此图的较大版本.

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Protocol

1. 一般准备

  1. 化学药品
    1. 将脂质（粉末形式）在CHCl 3 中溶解至 25 mg/mL，以制备预成型脂质体。
      注意：最好准备新鲜的脂质储备液，但储备溶液也可以在-20°C下储存数周。处理粉末形式的脂质比使用已溶于CHCl 3 的脂质更准确。CHCl3 应使用玻璃移液管和/或注射器处理，并储存在玻璃容器中，因为CHCl 3 会溶解塑料。
    2. 将小分子（核苷酸，氨基酸，荧光探针）溶解在50mM KPi（缓冲液A，参见 表1）中进行封装过程，并将pH调节至7.00±0.01。将 MgCl2 溶解在去离子水中，以避免形成磷酸镁沉淀物。
      注意：储备溶液可以在-20°C下储存数周，但DTT除外，DTT是在实验当天新鲜制备的。
    3. 将离子载体（例如，缬氨霉素，尼日利亚菌素）溶解在DMSO或EtOH中，储备浓度为100-500μM。 在-20°C下储存数周;避免蒸发。
      注意：DMSO不具有挥发性，因此优于EtOH。使用玻璃代替塑料小瓶，以避免离子载体粘附在小瓶表面。
  2. 缓冲区
    1. 在实验当天准备新鲜的缓冲液（表1）。不要储存超过 24 小时。
  3. 可溶性蛋白的纯化
    1. 表达 ArcA、ArcB、ArcC（我们使用名为 ArcC1 的特定变体）、PercevalHR 和 GlpK，如前所述 27,28,33。确保将 10% v/v 甘油添加到细胞裂解缓冲液中，这可增强蛋白质的稳定性。纯化可溶性蛋白质，如27,28,33所述，并在下文中不久报道。
    2. 在冰水浴中解冻 10 mL 细胞裂解物（~5 g 湿重）。同时，将 2 mL （1 CV） Ni2+-琼脂糖树脂加入加入去离子水 （12 CV） 和缓冲液 B （4 CV） 的重力流柱（容量为 20 mL ）进行洗涤。将解冻的裂解物转移到冰中;除非另有说明，否则在冰上工作。
    3. 将终浓度为 10 mM 的咪唑加入解冻的裂解物中，然后将溶液倒入重力流柱上。在4°C下孵育1小时，轻轻跳动。
    4. 1小时后，丢弃流出的液体，并用缓冲液C（20CVs）洗涤树脂。
    5. 用缓冲液 D 洗脱蛋白质，使用 60% CV 进行第一个洗脱步骤，然后进行 4-6 个 40% CV 步骤。
    6. 确定蛋白质浓度并加入Na-EDTA至终浓度为5mM。
    7. 在冷冻台式离心机（最大速度，10分钟，4°C）中旋转纯化的蛋白质。使用缓冲液 E 通过体积排阻色谱法纯化，将洗脱馏分汇集在一起，并使用截止值为 30 kDa 的浓缩过滤器将其浓缩至 ~10 mg/mL。制备适当大小的等分试样（~20μL），用液氮快速冷冻，并储存在-80°C以备后用。
      注意：重要的是将酶浓缩至 50-100 μM，以最小化封装所需的体积。
  4. 膜蛋白的纯化
    1. 如前所述，过表达 ArcD 和 GlpT 22,27,33。确保将 10% v/v 甘油添加到细胞裂解缓冲液中;对于ArcD的纯化，在缓冲液中加入2mM还原剂（例如DTT）。通过Ni2+-Sepharose色谱法纯化亲和标记的蛋白质。
      1. 在冰水浴中解冻等分试样的粗膜囊泡（10-20 mg总膜蛋白）。
        注意：解冻后，除非另有说明，否则请始终在冰上工作。请参阅 表 1 了解本节中使用的缓冲区。
      2. 将膜囊泡加入缓冲液 F （ArcD） 或缓冲液 G （GlpT） 中，最终体积为 6 mL。将样品在4°C下孵育1小时，轻轻章动。
      3. 通过超速离心（337,000×g，30分钟，4°C）将溶解的膜蛋白从膜碎片中分离出来。 同时，将 0.25 mL （1 CV） Ni2+-琼脂糖树脂加入含有去离子水 （40 CV） 和 20 CVs 缓冲液 H （ArcD） 或缓冲液 I （GlpT） 的重力流柱（容量为 10 mL）。
      4. 将溶解的蛋白质倒入重力流柱上，加入咪唑至终浓度为 10 mM。在4°C下孵育1小时，轻轻章动。
      5. 1小时后，丢弃流出物并用20CVs的缓冲液J（ArcD）或缓冲液K（GlpT）洗涤树脂。
      6. 用缓冲液L（ArcD）或缓冲液M（GlpT）以60%CV（1st）和40%CV（2nd-6th）步骤洗脱膜蛋白。
      7. 确定蛋白质浓度并继续执行第 2.2 节。用于膜重建。
        注：尺寸排阻纯化不一定对膜蛋白进行，因为膜重构会产生类似的纯化。步骤 1.4 和 2.2 可以在工作 1 天内完成。早上从蛋白质纯化（步骤1.4）开始，下午继续进行复溶（步骤2.2）。重建在第二天结束（有关详细信息，请参阅第 2.2 节）。停止点：纯化和 DDM 溶解的 ArcD 和 GlpT 可以在 -80 oC 下储存以备后用，但并非所有膜蛋白都是如此。制备适当大小（50-200μL）的等分试样，用液氮快速冷冻，并储存在-80°C以备后用。当在-80°C下，在10%v / v甘油存在下储存时，这些蛋白质具有数月的活性。
  5. 用于钝化目的的β-酪蛋白的制备
    1. 将 100 mg β-酪蛋白重悬于 20 mL 去离子水中，并用 1 M NaOH 滴定直至β-酪蛋白完全溶解。然后，加入 1 M 乙酸将 pH 调节至 7.0，并用去离子水填充体积至 50 mL。通过0.2μm注射器过滤器过滤溶液，并制备500μL的等分试样。
      注意：β-酪蛋白可以在-20°C下储存6个月。建议在使用前再次过滤β-酪蛋白，以避免β-酪蛋白聚集体堵塞微流控芯片。

缓冲区 组成
缓冲液 A 50 毫米 KPi pH 7.0
缓冲液 B 50 mM KPi，100 mM KCl，10% v/v 甘油，10 mM 咪唑，pH 7.5
缓冲液 C 50 mM KPi，100 mM KCl，10% v/v 甘油，50 mM 咪唑，pH 7.5
缓冲液 D 50 mM KPi，100 mM KCl，10% v/v 甘油，500 mM 咪唑，pH 7.5
缓冲液 E 50 mM KPi，100 mM KCl，10% v/v 甘油，pH 7.0
缓冲液 F 50 mM KPi，100 mM KCl，0.5% w/v DDM，10% v/v 甘油，2 mM β-巯基乙醇，pH 7.5
缓冲液 G 50 mM Tris-HCl，0.5% w / v DDM，20% v / v甘油，pH 8
缓冲液 H 50 mM KPi，100 mM KCl，0.02% w / v DDM，10% v / v甘油，2 mM β-巯基乙醇，10 mM咪唑，pH 7.5
缓冲液 I 50 mM Tris-HCl，0.04% w / v DDM，20% v / v甘油，10 mM咪唑，pH 8.0
缓冲液 J 50 mM KPi，200 mM KCl，0.02% w / v DDM，10% v / v甘油，2 mM β-巯基乙醇，50 mM咪唑，pH 7.5
缓冲液 K 50 mM Tris-HCl，0.04% w / v DDM，20% v / v甘油，50 mM 咪唑，pH 8
缓冲液 L 50 mM KPi，200 mM KCl，0.02% w / v DDM，10% v / v甘油，2 mM β-巯基乙醇，500 mM咪唑，pH 7.5
缓冲液 M 50 mM Tris-HCl，0.04% w / v DDM，20% v / v甘油，500 mM咪唑，pH 8
缓冲液 N 50 mM KPi，58 mM NaCl，2 mM DTT，pH 7.0
缓冲液 O 50 mM KPi，0.5 mM L-鸟氨酸，10 mM Na-ADP，10 mM MgCl2,2 mM DTT，pH 7.0
缓冲液 P 50 mM KPi pH 7.0,2 mM DTT，x mM 葡萄糖（x 变化以匹配外部和内部培养基的渗透压）
缓冲液 Q 50 mM KPi pH 7.0,0.5 mM 蔗糖，2 mM DTT
缓冲液 R 50 mM KPi pH 7.0,2 mM DTT，10 mM L-精氨酸，x mM 葡萄糖

表 1：此协议中使用的缓冲区。

2. 蛋白脂质体：将纯化的膜蛋白重建为预先形成的脂质囊泡

  1. 第1天
    1. 预制脂质囊泡的制备
      1. 根据膜蛋白的要求选择脂质组成（例如，合成磷脂、 大肠杆 菌极性脂质）。
        注意：DOPE、DOPG 和 DOPC 的混合物（25：25：50 mol%）是一个很好的起点，但某些蛋白质可能需要甾醇或心磷脂;对于酵母质膜蛋白，我们使用棕榈酰油酰脂质代替二油酰30。DOPE、DOPG 和 DOPC （25：25：50 mol%） 混合物足以重建 ArcD 和 GlpT。
      2. 混合所需的脂质（溶解在CHCl3中）并在旋转蒸发器中蒸发CHCl 3 ，直到形成脂质膜。通过加入与CHCl3相同体积的乙醚来洗涤脂质。蒸发乙醚，得到干燥的脂质膜。
      3. 将脂质膜重悬至水性培养基（缓冲液 A）中的总脂质为 20 mg/mL。从总体积的一半开始，轻轻摇晃;然后，小心地将脂质转移到足够大小的干净管子或瓶子中。将新鲜的缓冲液 A 加入烧瓶中，并重复该过程以溶解剩余的脂质并将它们转移到新容器中。添加额外的缓冲液 A 以达到 20 mg/mL 的终浓度。
      4. 使用探针超声仪对重悬的脂质进行超声处理。对于直径为 6 mm 的超声探头，请使用以下参数：4 μm 强度，70% 振幅，5 秒开启，45 秒关闭，16 个周期。将脂质浸入含有EtOH的冰水浴中，以避免超声处理过热。
      5. 在液氮中快速冷冻超声处理的样品（在 50 mL 离心管中的体积为 40 mL），并在室温下的水浴中解冻样品。重复一次;然后，将脂质体分装成所需体积（例如，在 1.5 mL 塑料管中加入 1 mL 或 20 mg 总脂质）。
        停止点：此时可以停止该过程。再次快速冷冻每个等分试样（第三个循环），并在液氮中储存长达几个月。注意用针刺穿管盖两次，以避免液氮快速沸腾时管子爆炸。
  2. 第2天
    1. 将纯化的膜蛋白重建为预形成的脂质体
      1. 在室温下在水浴中解冻一份脂质体（20mg总脂质）。同时，通过应用所选过滤器（例如，聚碳酸酯，孔径为 400 nm）来准备挤出机;用缓冲液A预平衡挤出机;并将解冻的脂质体（“乳状溶液”）装入挤出机中，并将它们 13 次通过过滤器。收集挤出的脂质体（现在是大的单层囊泡;“不透明溶液”），放入足够大小的玻璃或塑料容器（例如，15 mL）中。用补充有 2 mM DTT 的缓冲液 A 将脂质体稀释至 4 mg/mL。
      2. 将 1 mL 4 mg/mL 脂质体转移到 1 mL 透明比色皿中。在分光光度计中，测量 540 nm 处的初始光密度。将测量的样品倒回，并向脂质体中加入 50 μL 10% v/v Triton X-100。
        注：50 μL 10% Triton-X100 的滴定体积适用于 5 mL 体积的 20 mg 脂质;添加Triton X-100将使脂质稀释~5%。在处理不同量的脂质体时调整滴定体积。为了获得稳定的光密度信号，在室温下用 Triton X-100 滴定脂质体。
      3. 重复步骤 2.2.1.2 并注意何时达到最大光密度 （Rsat）。继续进行滴定，直到达到约60% Rsat 的光密度（图4）。将洗涤剂不稳定的囊泡倒回玻璃/塑料管中（最终体积现在约为 5.2 mL），将样品转移到冰中，并让其冷却。
      4. 将纯化的膜蛋白添加到不稳定的脂质体中，以达到所需的脂质与蛋白质比率 （w/w）。使用 400：1 的比率降至 100：1 w/w;由于 ArcD 和 GlpT 的分子量均为 ~55 kDa，因此脂质与蛋白质的比率为 400：1 w/w 相当于每个蛋白质 ~30,000 个脂质，每个直径为 400 nm 的囊泡 ~ 50 个 ArcD 和 GlpT 分子。
        注意：这里我们使用 400：1 w/w， 相当于每 20 mg 脂质中每种蛋白质 50 μg。
      5. 将样品在4°C下章动15分钟，以使膜蛋白插入不稳定的脂质体膜中。
      6. 要去除清洁剂，请加入 200 毫克干燥的聚苯乙烯珠，按照制造商的说明制备。在4°C下再酸15分钟。
        注意：200 mg 干珠的量适用于 20 mg 脂质，但在使用不同的样品量时应进行调整。
      7. 重复步骤2.2.1.6 2x，共加三次聚苯乙烯珠。然后，在4°C下孵育过夜，轻轻章动。
  3. 第3天
    1. 重复步骤 2.2.1.6;然而，这一次，在4°C下形成章托1小时。
    2. 将空的重力流柱（10 mL 容量）固定在冰上的空 6.5 mL 超速离心管上方。将样品倒入色谱柱中，并将蛋白脂质体收集在超速离心管中（珠子保留在色谱柱中）。
    3. 用补充有 2 mM DTT 的 0.5 mL 缓冲液 A 洗涤珠子，并将滤液收集在超速离心管中。
    4. 通过超速离心（337,000×g，30分钟，4oC）浓缩蛋白脂质体。将总体积为 200 μL（100 mg 脂质/mL）的蛋白脂质体重悬于补充有 2 mM DTT 的缓冲液 A 中;离心后囊泡的干体积为 ~40 至 120 μL27。分成所需大小的等分试样（例如，三个等分试样，每份 6.66 mg 总脂质）。
      注意：等分试样大小是任意的，但会影响后续步骤中的颗粒大小（参见步骤 3.2.3.1）。停止点：该过程可以在此处停止。将每个等分试样快速冷冻并在液氮中储存长达数周。注意用针刺穿管盖两次，以避免液氮快速沸腾时管子爆炸。

Figure 4
图 4：使用 Triton X-100 滴定预形成的脂质体。 将5mg脂质/ mL的脂质体通过聚碳酸酯过滤器（400nm）在50mM KPi（pH 7.0）中挤出，然后用Triton X-100滴定（方案步骤2.2.1.2）。囊泡的浊度在 A540 处测量。箭头表示 Triton X-100 浓度，在该浓度下，囊泡充分不稳定以自发插入膜蛋白，如19 中所述。 请点击这里查看此图的较大版本.

3. 在亚微米大小的囊泡中封装用于 ATP 循环和甘油 3-P 合成的代谢网络

  1. 第1天
    1. 组分混合
      1. 对于标准包封，使用 66.6 μL 蛋白脂质体，最终体积为 200 μL（33.33 mg/mL 总脂质）。计算达到所需浓度所需的每种组分（酶、辅因子）的体积，将这些组分添加到蛋白脂质体中，并用缓冲液A将体积调节至200μL（表2）。
        注：蛋白质浓度可以根据实验设置进行调整。然而，应注意每个囊泡平均存在每种酶的几个拷贝 （>10），以避免不希望的随机效应。浓度> 1 μM 通常是安全的;直径为400nm的囊泡中的1μM对应于大约20个拷贝（图3）。
      2. 将缓冲液 A 移液到空的 1.5 mL 管中，并加入 DTT、Na-ADP、MgCl2、L-鸟氨酸（和吡喃氨酸，如果需要用于内部 pH 测量）。接下来，加入酶并轻轻混合。将溶液加入预先形成的蛋白脂质体顶部，并以低速短暂涡旋。
        注意：在 MgCl2 之前添加 Na-ADP 很重要，以避免不希望的磷酸镁沉淀物的形成。需要涡旋才能正确混合粘性溶液;但是，应尽量减少持续时间和速度，以避免对蛋白质造成机械损伤。PercevalHR 和吡喃不能共封装，因为它们的光谱重叠。
    2. 内渗透压的测定
      1. 如步骤3.1.1.1所述制备50μL溶液，但不含蛋白脂质体，并用冷冻点渗透压计测量渗透压。
      2. 使用缓冲液（50mM KPi，pH 7.0）和不同浓度的盐（例如，NaCl或NaCl）或糖制备校准曲线。确定与内部渗透压相匹配的渗透压浓度（缓冲液 N）。
        注意：膜渗透成分（例如甘油）不能用于匹配内部渗透压。对于溶解在含甘油缓冲液（例如缓冲液 E）中的蛋白质，应使用不含甘油的同一缓冲液。选择用于制备等渗外部缓冲液的渗透压应是膜不渗透的，并且不会干扰代谢网络。
    3. 冻融
      1. 将蛋白脂质体与可溶性成分一起快速冷冻（在液氮中），并在约10°C的水冰浴中解冻。
      2. 重复步骤 3.1.3.1，总共 5 次。
        停止点：该过程可以在此处停止。跳过最后的解冻步骤，将冷冻样品在液氮中储存 1-3 天。注意用针刺穿管盖 2 次，以避免在液氮快速沸腾时管子爆炸。最好在-80°C以上储存在液氮中，以尽量减少脂质氧化。
  2. 第2天
    1. 挤压
      注意：所有挤出步骤均在室温下进行，否则气密注射器会泄漏。
      1. 通过应用所选过滤器（例如，聚碳酸酯，孔径为 400 nm）来制备挤出机。用含有用于封装囊泡的相同缓冲液和代谢物的溶液（例如，缓冲液O加0.1mM吡喃）洗涤挤出机。
        注意：使用专用挤出机用吡喃填充蛋白脂质体，因为染料会粘附在挤出机表面，并可能导致后期样品中的污染。
      2. 将封装混合物装入挤出机中，并将其通过过滤器 13x。将挤出的溶液收集在 1.5 mL 试管中。
    2. 体积排阻色谱法（可选）
      注意：执行此步骤是为了通过尺寸排阻色谱法去除外部分子，例如吡喃等染料。如果系统中不存在染料，并且其他组分在低浓度下没有干扰（请注意，囊泡随后也通过超速离心洗涤），则步骤3.2.2。可以跳过。
      1. 将 Sephadex G-75 树脂重新水化并将其倒入玻璃柱（长 22 厘米，宽 1.5 厘米）中。用过量的外部缓冲液（例如缓冲 液 N）平衡树脂。
      2. 将步骤 3.2.1.2 中挤出的蛋白脂质体加载到预平衡的体积排阻色谱柱上，并应用外部缓冲液的重力流。丢弃空隙体积（约 7 mL）;然后，收集 10 份 1 mL 等分试样。通过短时间暴露于紫外线灯下，可视化含有蛋白脂质体的等分试样。混合含有大部分蛋白脂质体 （2-4 mL） 的馏分。
    3. 洗涤和重悬
      1. 通过超速离心洗涤挤出的蛋白脂质体。用 5.8 mL 缓冲液 N 填充 6.5 mL 超速离心管，然后将挤出的样品放在顶部。如果进行了大小排阻色谱分析，则用混合洗脱样品 （2-4 mL） 填充试管，并加入缓冲液 N 至最终体积为 6 mL。
      2. 以337,000× g离心，30分钟，4°C。 弃去上清液，并用无尘组织彻底干燥超速离心管，同时注意不要接触沉淀。将沉淀重悬于小体积缓冲液N（200μL）中。当沉淀完全重悬时，用缓冲液 N 填充试管至 6 mL。
        注意：重新悬浮颗粒需要时间，应小心进行。
      3. 重复步骤3.2.3.1-3.2.3.2 2x，总共洗涤三次，除非进行体积排阻色谱（在这种情况下，一个离心步骤就足够了）。最后，通过加入适当体积的缓冲液 N，将沉淀重悬至所需浓度（例如，5.55 mg/mL 总脂质）。
        停止点：蛋白脂质体可以立即使用或在 4o C 下储存至少 48 小时。超速离心管的尺寸应根据样品大小选择。对于 6.66 mg 总脂质的沉淀，6.5 mL 管是合适的。洗涤 200 μL 蛋白脂质体（总共 33.33 mg 脂质/mL;干沉淀体积 ~40 μL）28 用于 3 x 6 mL 缓冲液，每个洗涤步骤将外部组分稀释 100 倍。如果使用不同尺寸的管子，则希望相应地调整洗涤次数。
  3. 第3天
    1. 荧光检测ATP合成
      1. 在窗口为 3 x 5 mm、最小内部体积为 100 μL 的黑色石英比色皿中混合反应组分至最终体积为 120 μL（表 3）。
        注意：可以添加离子载体来消散电化学离子梯度。缬氨霉素和尼日利亚菌素的混合物（各1μM）可有效消散任何质子和钾梯度。
      2. 在设置为30°C的荧光计中预热样品，并获得PercevalHR的激发光谱（激发400-520nm，带宽5nm;发射550nm，带宽5nm）。一旦探针信号恒定，当ATP的循环与3-磷酸甘油的合成偶联时，通过添加过量的L-精氨酸（5-10mM）和甘油（400μM）来启动代谢网络。随着时间的推移跟踪反应。
    2. 数据分析
      1. 将比率 F500/F430 绘制为时间的函数，这是 ATP/ADP 比率的定性指标。为了对 ATP 的形成进行更定量的评估，在蛋白脂质体中构建校准曲线或使用补充方法（例如，通过化学发光28 进行 ATP 定量）。
元件 最终浓度
缓冲液 A 50 毫米 KPi pH 7.0
DTT 2毫米
Na-ADP钠 10毫米
氯化镁2 10毫米
L-鸟氨酸 0.5毫米
荧光探针（PercevalHR或吡喃） 分别为5.8μM或0.1mM
ArcA（精氨酸脱亚胺酶） 1微米
ArcB（鸟氨酸氨基甲酰转移酶） 2微米
ArcC1（氨基甲酸激酶） 5微米
GlpK（甘油激酶） 1.6微米
蛋白脂质体 33.33 mg/mL 总脂质

表 2：封装组件。 这些组件按相加顺序列出。可溶性蛋白质在缓冲液 E 中;所有其他组分（除去离子水中的 MgCl2 外）均在缓冲液 A 中。

元件 最终浓度
缓冲液 K 50 mM KPi pH 7.0,58 mM NaCl，2 mM DTT，pH 7.0
蛋白脂质体（5.55 mg/mL 脂质） 2.7 mg/mL 脂质
离子载体（缬氨霉素、尼日利亚菌素） 每个 1 μM

表3：实验条件。 这些组件按相加顺序列出。蛋白脂质体位于缓冲液 N 中，离子载体位于 DMSO 或 EtOH 中。

4. 扩大微米级囊泡的代谢网络

  1. 第1天
    1. 微流控芯片制备
      注：本实验使用Robinson等人34开发的微流体装置。微流控芯片的其他设计可用35,36,37，并且可以在该协议中轻松实现。
      1. 将 200 μL 移液器吸头从底部切开三分之一，并将吸头的底部插入预制的微流体捕获装置中。
      2. 向芯片的入口储液罐中加入 400 μL β-酪蛋白溶液 （2 mg/mL;参见步骤 1.5），注意防止在此步骤中引入空气。放置一个 96 孔板桶，并在台式锥形管离心机中加入实验室组织。将芯片放在组织顶部，以900× g 离心6分钟，以使微流体芯片钝化。离心步骤后，微流控芯片的进口储液罐和出口尖端的液位应相等;检查芯片是否泄漏。将β-酪蛋白溶液在微流控芯片中孵育至少 30 分钟。
      3. 在不引入空气的情况下去除大部分钝化溶液，并加入400μl洗涤缓冲液（缓冲液P）。将芯片放在 96 孔板桶上，并以 900 × g 离心 6 分钟。将芯片留在洗涤溶液中直至使用（最多 4 小时）。
  2. 用于制备蛋白-GUVs的凝胶制备
    注意：以下描述摘自25,38。
    1. 通过在微波炉中加热溶液，将 0.5% （w/w） 的低胶凝温度 （LGT） 琼脂糖溶解在去离子水中;确保琼脂糖已完全溶解，并避免将溶液煮沸。将琼脂糖保持在50°C，直到进一步使用。
      注意：溶解的琼脂糖可以在室温下储存数周。要重复使用琼脂糖，只需使用微波炉熔化凝胶即可。
    2. 取两张物镜载玻片，在载玻片上画出垫片的轮廓。通过等离子体清洗使载玻片亲水，使用高氧等离子体1分钟。
    3. 在载玻片顶部加入LGT琼脂糖，直到其完全被琼脂糖覆盖（~500μL）;然后，将载玻片倾斜90°，并将多余的琼脂糖排到组织上。将载玻片在50°C下放置30分钟。
    4. 将储存在液氮中的蛋白脂质体（第 3 节）并在冰上解冻。使用缓冲液 Q 将囊泡稀释至 5 mg/mL 脂质。
      注：在第 3 节中制备的蛋白脂质体不含可溶性蛋白质，如果储存在液氮中，可以提前制备。使用 proteoGUV 时，请确保始终过滤工作溶液，以防止微流体设备堵塞。
    5. 使用带有 1 mm 探针的手持式探针超声仪对蛋白脂质体进行超声处理。以 70% 振幅超声处理 10 个周期， 开启 0.5 秒， 关闭 0.5 秒。将囊泡（以下称为 proteoSUVs）保持在冰上 30 秒，并重复超声处理过程 5 次。
    6. 用 proteo-SUV 悬浮液填充 100 μL 注射器（在手持式 LCP 分配器中）。将 0.5 μL 蛋白 SUV 液滴沉积在先前制备的琼脂糖凝胶上;注意不要干扰琼脂糖层，并保持足够的距离以防止液滴融合。
      注意 使用手持式 LCP 分液器可以以可重复的方式进行液滴沉积，但也可以使用替代移液系统。用玻璃毛细管点样不太合适，因为它会干扰干燥的琼脂糖凝胶。
    7. 使用氮气流而不是压缩空气在~10分钟内干燥SUV液滴，以减少氧化脂质的可能性。
    8. 在缓冲液 A 中制备 1 mL 1.25x 浓缩缓冲液 O（表 4），并通过 0.2 μm 醋酸纤维素过滤器。取 800 μL 1.25x 浓缩溶液，加入可溶性酶和探针至 表 4 中指示的浓度。使用过滤的去离子水使最终体积为 1 mL。
    9. 制备 100 μL 含有 表 4 所有组分（蛋白质和甘油除外）的溶胀溶液。使用 3 点校准的凝固点渗透压计测量溶胀溶液的渗透压。
      注：制备 100 μL 不含蛋白质和甘油的溶胀溶液，以准确测定该溶液的渗透压。存在于蛋白质溶液中的甘油会影响渗透压，但在 GUV 中，甘油会迅速扩散到膜上，仅导致瞬时渗透压差异。
    10. 通过制作包含凝胶和干燥 SUV 的两个物镜夹层来组装 GUV 溶胀室，中间有一个 1.5 或 3.0 mm 厚的特氟龙垫片。然后，使用注射器和针头通过侧面的小孔将溶胀溶液添加到腔室中。
      注意：溶胀溶液的体积可以通过在 1.5 到 3.0 毫米之间改变垫片来调节。
  3. 囊泡肿胀和 GUV 的收获
    1. 通过将腔室置于22°C至少30分钟，使囊泡肿胀。
      注：如果蛋白质或脂质是荧光标记的，则可以通过光学显微镜（例如，台式相差显微镜或宽场荧光显微镜）跟踪囊泡的肿胀。
    2. 通过在固体表面（例如，实验室工作台）上敲击腔室，应用温和的物理搅拌，从凝胶中收获GUV;取出三分之一的体积，并使用产生的气泡轻轻地引起剩余液体的运动，从而将 GUV 从凝胶中分离出来。
    3. 当GUVs溶胀时，准备缓冲液P并通过调节葡萄糖浓度使渗透压与溶胀溶液相匹配。通过0.2μm注射器过滤器过滤缓冲液。
      注：一般情况下，洗涤液和底物溶液应保持在5 mosmol/kg±以内。任何通过芯片的溶液都应该非常干净，因为污染物可能会堵塞通道。每次制作新鲜缓冲液或将准备好的缓冲液储存在-20°C并在使用前过滤。
  4. 捕获用于显微镜实验的 GUV
    1. 将钝化微流控芯片安装在显微镜的样品台上。检查可能的缺陷（例如，泄漏、滞留空气、管道堵塞）。
      注意： 可以在使用之前检查芯片，以便在必要时可以准备新芯片。
    2. 使用弯曲的针头将管子连接到储液器的出口，并将另一端连接到 1 mL 注射器。将注射器安装到泵上，并将流速设置为最大 10 μL/min。
    3. 从储液罐中取出洗涤缓冲液（步骤 4.1.1.3）并更换为新鲜培养基（缓冲液 P）。通过注射器以 1-10 μL/min 的速度输注，开始缓冲液流过芯片。用至少 80 μL 渗透平衡洗涤缓冲液（缓冲液 P）洗涤。
    4. 从储液槽中取出多余的洗涤缓冲液，并将（蛋白）GUVs添加到储液槽中。将流速调节至 0.1-1 μL/min，使 GUV 流过芯片。随着时间的推移监测芯片，直到有足够的 GUV 被困在芯片中。
      注：具有相对大量 （>20 mol%） 带电脂质的囊泡，如磷脂酰甘油 （PG）、磷脂酰丝氨酸 （PS） 或磷脂酸 （PA） 或非双层形成脂质（如磷脂酰乙醇胺 （PE） ）以较低的流速引入芯片，以防止破裂。由纯磷脂酰胆碱（PC）组成的囊泡往往更稳定。
    5. 除去多余的GUV溶液并加入洗涤缓冲液P，使用0.1-1μL / min的恒定流速，交换外部培养基并洗涤捕获的GUVs至少1小时，以去除未包封的化合物并降低荧光团包封时的背景荧光。监测背景荧光随时间的变化;如果背景荧光不减弱，芯片可能被阻挡。
    6. 定位具有足够量囊泡的陷阱并保存其位置。应用显微镜上的设置（例如，激光强度、增益、波长）并开始时间序列实验。
    7. 向储液槽中加入渗透平衡的底物溶液（缓冲液 R），并开始流速为 0.5 μL/min。

缓冲液 L 组分
元件 1.25 x 浓度 工作专注力
缓冲液 A 62.5毫米KPi，pH 7.0 50 毫米 KPi pH 7.0
蔗糖 125毫米 100毫米
DTT 2.5毫米 2毫米
Na-ADP钠 12.5毫米 10毫米
氯化镁2 12.5毫米 10毫米
L-鸟氨酸 0.625毫米 0.5毫米
封装组件
Pyranine 或 PercevalHR 1 mM 或 20 μM
ArcA（精氨酸脱亚胺酶） 1微米
ArcB（鸟氨酸氨基甲酰转移酶） 2微米
ArcC1（氨基甲酸激酶） 5微米

表 4：缓冲液 O 和封装组分。 这些组件按相加顺序列出。所有组分（去离子水中的 MgCl2 除外）均在缓冲液 A 中。所有水溶性蛋白质都在缓冲液 E 中。

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Representative Results

脂质体中溶解膜蛋白的重建需要破坏预形成的囊泡的稳定性。添加少量的Triton X-100最初导致540nm（A540）处的吸光度增加，这是由于囊泡的膨胀导致光散射的增加（图4）。最大 A540 值是脂质体被洗涤剂 （Rsat） 饱和的点，之后任何进一步添加 Triton X-100 都将导致囊泡的部分溶解。在 Rsol时， 脂质体完全溶解（图4）。对于膜蛋白的重建，我们通常使用不稳定到 超过 Rsat 的 60%（箭头表示）的囊泡。

重组膜蛋白 ArcD 用于将 L-精氨酸转运到囊泡中，将 L-鸟氨酸转运出囊泡，并与包封的酶 ArcA、ArcB 和 ArcC 一起用于从 ADP 和无机磷酸盐中回收 ATP。GlpT 是一种甘油 3-磷酸/磷酸逆向转运剂，与 GlpK 一起是 L-精氨酸分解产生的甘油加 ATP 合成（和排泄）甘油 3-磷酸所必需的。在 t = 0 时向蛋白脂质体添加 5 mM L-精氨酸导致 500 和 430 nm 激发39 处的 PercevalHR 荧光比率急剧增加，这反映了囊泡内的 ATP/ADP 比率（图 5）。加入甘油后，ATP 用于合成 3-磷酸甘油，这导致 ATP/ADP 比率降低28。L-精氨酸的分解也会导致 pH 值变化，可以使用吡喃或 pHluorin27 进行量化。

Figure 5
图 5：L-精氨酸分解途径对 ATP 的循环。 将2.7mg脂质/ mL的LUV置于比色皿中，并记录500nm和430nm处的荧光比率。在 t = 0时加入5mM L-精氨酸。F500/F430 比率是囊泡内 ATP/ADP 比率的量度。缩写：LUVs = 大单层囊泡。 请点击这里查看此图的较大版本.

产生 ATP 的 LUV 也可用于形成 GUV。在LGT琼脂糖凝胶上干燥的蛋白-LUV的再水化导致微米级囊泡的形成（图6）。在干燥的LUV斑点中蛋白-GUVs的形成在很大程度上取决于脂质的局部浓度和脱水程度。有些地区有大片的 GUV，而在同一液滴的其他地方，可以形成没有或很少的 GUV。通过LGT琼脂糖辅助肿胀形成GUVs导致一系列GUV大小，通常从几微米到超过50μm。

Figure 6
图 6：由凝胶辅助溶胀形成的 proteoGUV 的 DIC 图像。 比例尺 = 25 μm。缩写：DIC=微分干涉对比;GUV = 巨单层囊泡。 请点击这里查看此图的较大版本.

GUV 被收获并捕获在基于 β 酪蛋白钝化的 PDMS 微流体装置中（图 7）。该装置的设计方式是可以在一次实验中捕获和分析许多囊泡，并且该装置用于控制外部环境（流速、缓冲液组成等）。34. 即使蛋白-GUVs的产量较低，GUVs通过微流控芯片的恒定流动也使得许多囊泡被收集起来。一旦捕获了足够的 GUV，就会用渗透平衡缓冲液洗涤系统，以去除可溶性蛋白质、小分子和荧光探针等外部成分。然后用含有50mM KPi（pH 7.0）、不同量的葡萄糖（用于调节渗透压）和10mM L-精氨酸等渗透压的等渗透压的底物溶液替换洗涤缓冲液。在微流控芯片的几个陷阱上进行时间序列实验，每90秒拍摄一次图像（使用PercevalHR时为405nm和488nm激发）。此外，在每个时间点拍摄明场图像。在 488 和 405 nm 激发后的发射强度比是囊泡中 ADP/ATP 比值的量度。

Figure 7
图 7：使用微流控芯片捕获囊泡。 （A）囊泡的捕获，伴随着控制外部环境和流速的能力。（B） 捕获在微流体装置中并用 405 nm 激光（绿色）和 488 激光（红色）激发的 ProteoGUVs。两个通道的发射均在 >500 nm 处测量。明场图像允许在没有荧光的情况下观察囊泡。比例尺 = 25 μm。缩写：GUVs = 巨单层囊泡。 请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

我们提出了一种方案，用于合成含有亚微米大小脂质囊泡（proteoLUVs）的（膜）蛋白，并将proteoLUVs转化为巨型单层囊泡（proteoGUVs）。该方案应适用于其他膜蛋白13,19,30,40的重建和除此处介绍的L-精氨酸分解和甘油3-磷酸合成途径以外的代谢网络的包封。

脂质体中膜蛋白的重建通常产生脂质膜内蛋白质的随机取向。对于 ArcD 和 Glpt，取向无关紧要，因为蛋白质是双向操作的，溶质根据总电化学势的符号移动。对于在一个方向上起作用的蛋白质，当它们的取向为 50/50 时，一半的分子将无法进行活动。

囊泡通过聚碳酸酯过滤器的挤出使尺寸分布变窄，并且过滤器的孔径越小，囊泡就越均匀。然而，较小的囊泡的代价是体积较小，因此每个囊泡的蛋白质（酶、膜蛋白）数量非常少。为了最小化具有一种或多种组分缺失的LUV的比例，可以调整蛋白质的浓度，如图3A，B所示，但是对于非常小的囊泡，随机效应是不可避免的。

凝胶辅助溶胀方法依赖于超声发酵囊泡 （SUV） 在干燥的琼脂糖表面上的沉积。在干燥过程中，形成囊泡的浓度梯度，脂质浓度在斑点的外围最高。这是由于一种称为咖啡渍效应的现象41,42。因此，斑点内只有一小块区域含有适合 GUV 形成的脂质浓度。圆形不均匀浓缩的脂质斑点导致大面积的未使用区域，这些区域无法用于囊泡融合;因此，在这种方法中，GUV形成的效率变得较低。为了提高 GUV 的产量，应以均匀的脂质沉积为目标，这可以通过旋涂42 或利用咖啡染色效应41 来实现。

关于该协议的进一步说明：

应注意每个囊泡平均重建几种膜蛋白 （>10），以避免随机效应。因此，避免脂质与蛋白质的比率高于 400：1 w/w。对于大多数蛋白质，假设取向是随机的。

理想情况下，总膜蛋白的体积尽可能小，并且无论如何不超过脂质体体积的 10-20%。增加更大的体积会引入更多的去污剂，并且大多数预形成的脂质体可能会裂解，这可能会对复溶效率产生负面影响。

用适当的溶液对挤出机进行预平衡对于避免在封装过程中稀释组分非常重要。理想情况下，预平衡溶液还应包含可溶性酶，但由于挤出机的预平衡需要相对较大的体积，因此包含酶的成本可能太高。因此，我们通常会省略这些成分，并接受酶的 5% 稀释度。

应将离子载体添加到含有蛋白脂质体的混合物中，因为这些分子具有高度疏水性，如果不存在囊泡，可能会吸附到表面。应注意溶剂添加量低（占总反应体积的<1%）。进行控制以验证溶剂不会影响囊泡中的代谢网络。对于~3 mg/mL的总脂质浓度，约1μM的离子载体浓度通常是安全的。

应注意彻底干燥液滴。如果液滴不够干燥，则 GUV 的形成效率较低，因为脂质会形成脂质聚集体，并且当加入溶胀溶液时可能会形成 MLV。

葡萄糖用于匹配外部介质与内部介质的渗透压;后者含有蔗糖而不是葡萄糖，以增加囊泡的密度，从而促进 GUV 的沉淀。此外，外部环境中的葡萄糖增强了相差，使囊泡更容易看到。

随机效应对 GUV 来说问题要小得多;但在这里，表面与体积比可能会变得低得令人无法接受，以至于膜蛋白（例如，转运蛋白）的数量对内部代谢网络变得有限。该协议中描述的方法不允许精确控制proteoGUV的大小，但大多数落在5-50μm的大小范围内。

总之，本文介绍的工作全面概述了不同大小的脂质囊泡中的膜蛋白重建和酶包封。我们展示了用于合成 ATP 的功能性囊泡的构建，以及由氨基酸和甘油等简单前体构建的构建块。在GUVs中重建膜蛋白仍然具有挑战性，但本文提出的方案为自下而上的合成生物学研究的进一步发展铺平了道路。

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Disclosures

提交人声明没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

作者感谢 Aditya Iyer 克隆了 pBAD-PercevalHR 基因，并感谢 Gea Schuurman-Wolters 帮助蛋白质生产和纯化。该研究由NWO引力计划“构建合成细胞”（BaSyC）资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Aldrich A9414-25g
Amicon cut-off filter Sigma Aldrich Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra 
BioBeads BioRad 152-3920
CHCl3 Macron Fine Chemicals MFCD00000826
D(+)-Glucose Formedium -
D(+)-Sucrose Formedium -
DDM Glycon D97002 -C
Diethyl Ether Biosolve 52805
DMSO Sigma-Aldrich 276855-100ml
DOPC Avanti 850375P-1g
DOPE Avanti 850725P-1g
DOPG Avanti 840475P-1g
DTT Formedium  DTT005
EtOH J.T.Baker Avantor MFCD00003568
Extruder Avestin Inc LF-1
Fluorimeter Jasco Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol BOOM 51171608
Gravity flow column Bio-Rad 732-1010
Hamilton syringe 100 µL Hamilton 7656-01
Hamilton syringe 1000 µL Hamilton 81320
Handheld LCP dispenser Art Robbins Instruments 620-411-00
Handheld Sonicator Hielscher Ultrasound Technology UP50H
HCl BOOM x76021889.1000
Imidazole Roth X998.4-250g
K2HPO4 Supelco 1.05099.1000
KCl BOOM 76028270.1
KH2PO4 Supelco 1.04873.1000
Kimwipe Kimtech Science 7552
Large Falcon tube centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006-100G
Light microscope Leica DM LS2
L-Ornithine Roth T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670-1KG
Microfluidic chip Homemade  PDMS based DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP Sigma-Aldrich A2754-1G
NaCl Supelco 1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer Isogen Life Science ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH Supelco 1.06498.1000
Needles for GUVs Henke-Ject 14-14575 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics Henke-Ject 14-15538 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose Cytiva 17526802
Nigericin Sigma-Aldrich N7143-5MG
Nutator VWR 83007-210
Osmolality meter Gonotec Salmenkipp Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner Plasma Etch PE-Avenger
Polycarbonate filter Cytiva Whatman Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 355647
Pyranine Acros Organics H1529-1G
Quartz cuvette (black) Hellma Analytics 108B-10-40
Sephadex G-75 resin  GE Healthcare 17-0050-01
Sonicator Sonics Sonics & Materials INC Sonics vibra cell
Syringe filter Sarstedt Filtropur S plus 0.2 0.2 µm
Syringe pump Harvard Apparatus A-42467
Tabletop centrifuge Eppendorf centrifuge 5418
Teflon spacer Homemade  Teflon based 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris PanReac AppliChem A1086.1000
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100 ml
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima Max-E
UV lamp Spectroline ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer Jasco V730 spectrophotometer
Valinomycin Sigma-Aldrich V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope Zeiss AxioObserver
β-Casein Sigma Aldrich C5890-500g

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References

  1. Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
  2. Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges. Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).
  3. Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. Industrial biomanufacturing: The future of chemical production. Science. 355 (6320), (2017).
  4. Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design. Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).
  5. Wang, A., et al. Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168 (2020).
  6. Kanter, G., et al. Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines. Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).
  7. Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).
  8. Jain, K. K. Synthetic biology and personalized medicine. Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).
  9. Schwille, P., Frohn, B. P. Hidden protein functions and what they may teach us. Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).
  10. Sachsenmeier, P. Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology. Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).
  11. Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).
  12. Godoy-Hernandez, A., et al. Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions. ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).
  13. Sikkema, H. R., et al. Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA. Sci Adv. 6 (47), 7697 (2020).
  14. Foucaud, C., Poolman, B. Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport. J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).
  15. Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization. Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).
  16. Simidjiev, I., et al. Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro. Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).
  17. Harris, N. J., Booth, P. J. Folding and stability of membrane transport proteins in vitro. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).
  18. Jackson, M. L., Litman, B. J. Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).
  19. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  20. Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).
  21. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).
  22. Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1 (2023).
  23. Lee, K. Y., et al. Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system. Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).
  24. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. Methods in Enzymology. , Elsevier. 161-176 (2009).
  25. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J. Vis. Exp. (95), e52281 (2015).
  26. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  27. Pols, T., et al. A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis. Nat Commun. 10 (1), 4239 (2019).
  28. Bailoni, E., Poolman, B. ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis. ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).
  29. Van Der Heide, T. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).
  30. Van'T Klooster, J. S., et al. Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).
  31. Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations. Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).
  32. Weiss, M., et al. Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics. Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).
  33. Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown. FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).
  34. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  35. Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459 (2019).
  36. Elias, M., et al. Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette. Micro Nano Eng. 8, 100064 (2020).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 044105 (2013).
  38. Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths. Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).
  39. Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4 (1), 2550 (2013).
  40. Setyawati, I., et al. In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters. eLife. 9, e64389 (2020).
  41. Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles. Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).
  42. Estes, D. J., Mayer, M. Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).

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失衡代谢网络、膜蛋白重建、大单层囊泡 （LUV）、巨型单层囊泡 （GUV）、生物反应器、基于荧光的传感器、酶包封、代谢物包封
在纳米和微米大小的囊泡中构建失衡代谢网络
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Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, B. Construction of Out-of-Equilibrium Metabolic Networks in Nano- and Micrometer-Sized Vesicles. J. Vis. Exp. (206), e66627, doi:10.3791/66627 (2024).

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