Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Konstruktion af metaboliske netværk uden for ligevægt i vesikler i nano- og mikrometerstørrelse

Published: April 12, 2024 doi: 10.3791/66627
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Groningen

Summary

Vi præsenterer en protokol til rekonstituering af membranproteiner og indkapsling af enzymer og andre vandopløselige komponenter i lipidvesikler af submikrometer- og mikrometerstørrelse.

Abstract

Vi præsenterer en metode til at inkorporere komplekse proteinnetværk i vesikler, der involverer integrerede membranproteiner, enzymer og fluorescensbaserede sensorer, ved hjælp af oprensede komponenter. Denne metode er relevant for design og konstruktion af bioreaktorer og studiet af komplekse metaboliske reaktionsnetværk uden for ligevægt. Vi starter med at rekonstituere (flere) membranproteiner til store unilamellære vesikler (LUV'er) i henhold til en tidligere udviklet protokol. Vi indkapsler derefter en blanding af oprensede enzymer, metabolitter og fluorescensbaserede sensorer (fluorescerende proteiner eller farvestoffer) via fryse-tø-ekstrudering og fjerne ikke-inkorporerede komponenter ved centrifugering og/eller størrelsesudelukkelseskromatografi. Ydeevnen af de metaboliske netværk måles i realtid ved at overvåge ATP/ADP-forholdet, metabolitkoncentrationen, intern pH eller andre parametre ved fluorescensudlæsning. Vores membranproteinholdige vesikler med en diameter på 100-400 nm kan omdannes til gigantiske unilamellære vesikler (GUV'er) ved hjælp af eksisterende, men optimerede procedurer. Tilgangen muliggør inkludering af opløselige komponenter (enzymer, metabolitter, sensorer) i mikrometerstore vesikler og dermed opskalere volumenet af bioreaktorerne med størrelsesordener. Det metaboliske netværk, der indeholder GUV'er, er fanget i mikrofluidiske enheder til analyse ved optisk mikroskopi.

Introduction

Området for bottom-up syntetisk biologi fokuserer på konstruktion af (minimale) celler 1,2 og metaboliske bioreaktorer til bioteknologiske 3,4 eller biomedicinske formål 5,6,7,8. Konstruktionen af syntetiske celler giver en unik platform, der giver forskere mulighed for at studere (membran) proteiner under veldefinerede forhold, der efterligner dem i native miljøer, hvilket muliggør opdagelsen af emergente egenskaber og skjulte biokemiske funktioner af proteiner og reaktionsnetværk9. Som et mellemliggende skridt mod en autonomt fungerende syntetisk celle udvikles moduler, der fanger væsentlige træk ved levende celler såsom metabolisk energibevarelse, protein- og lipidsyntese og homeostase. Sådanne moduler forbedrer ikke kun vores forståelse af livet, men har også potentielle anvendelser inden for medicin8 og bioteknologi10.

Transmembranproteiner er kernen i stort set ethvert metabolisk netværk, da de transporterer molekyler ind eller ud af cellen, signalerer og reagerer på miljøets kvalitet og spiller adskillige biosyntetiske roller. Således kræver konstruktionen af metaboliske moduler i syntetiske celler i de fleste tilfælde rekonstituering af integrerede og/eller perifere membranproteiner til et membrandobbeltlag sammensat af specifikke lipider og høj integritet (lav permeabilitet). Håndteringen af disse membranproteiner er udfordrende og kræver specifik viden og eksperimentelle færdigheder.

Der er udviklet flere metoder til at rekonstituere membranproteiner i fosfolipidvesikler, oftest med det formål at studere funktionen11,12, regulering13, kinetiske egenskaber14,15, lipidafhængighed15,16 og/eller stabilitet17 af et specifikt protein. Disse metoder omfatter hurtig fortynding af vaskemiddelopløseligt protein til vandige medier i nærvær af lipider18, fjernelse af vaske- og rengøringsmidler ved inkubation af vaskemiddelopløseligt protein med vaskemiddeldestabiliserede lipidvesikler og absorption af vaske- eller rengøringsmiddelet eller vaske- og rengøringsmidlerne på polystyrenperler19 eller fjernelse af vaske- og rengøringsmidler ved dialyse eller størrelsesudelukkelseskromatografi20. Organiske opløsningsmidler er blevet brugt til at danne lipidvesikler, for eksempel via dannelsen af olie-vand-interfaser21, men størstedelen af integrerede membranproteiner inaktiveres, når de udsættes for sådanne opløsningsmidler.

I vores laboratorium rekonstituerer vi for det meste membranproteiner ved hjælp af vaskemiddelabsorptionsmetoden for at danne store unilamellære vesikler (LUV'er)19. Denne metode tillader samrekonstituering af flere membranproteiner og indkapsling i vesikellumen af enzymer, metabolitter og prober22,23. De membranproteinholdige LUV'er kan omdannes til gigantiske unilamellære vesikler (GUV'er) med/uden indkapsling af vandopløselige komponenter ved hjælp af enten elektrodannelse24 eller gelassisteret hævelse25 og specifikke betingelser for at bevare membranproteinernes integritet26.

Denne artikel præsenterer en protokol til rekonstituering i LUV'er af et metabolisk netværk uden for ligevægt, der regenererer ATP gennem nedbrydning af L-arginin til L-ornitin27. Dannelsen af ATP er koblet til produktionen af glycerol-3-phosphat (G3P), en vigtig byggesten for fosfolipidsyntese22,28. Den metaboliske vej består af to integrerede membranproteiner, en arginin/ornitin (ArcD) og en G3P/Pi-antiporter (GlpT). Derudover kræves tre opløselige enzymer (ArcA, ArcB, ArcC) til genanvendelse af ATP, og GlpK bruges til at omdanne glycerol til glycerol 3-phosphat ved hjælp af ATP fra nedbrydningen af L-arginin, se figur 1 for en skematisk oversigt over vejen. Denne protokol repræsenterer et godt udgangspunkt for den fremtidige konstruktion af endnu mere komplekse reaktionsnetværk - til syntese af lipider eller proteiner eller deling af celler. Vesiklernes lipidsammensætning understøtter aktiviteten af en lang række integrerede membranproteiner og er optimeret til transport af forskellige molekyler ind i eller ud af vesiklerne 27,29,30.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over vejen for ATP-produktion og glycerol-3-phosphatsyntese og -udskillelse, klik her for at se en større version af denne figur.

Kort sagt tilsættes rensede membranproteiner (opløst i dodecyl-β-D-maltosid, DDM) til præformede lipidvesikler, der er blevet destabiliseret med Triton X-100, hvilket tillader indsættelse af proteinerne i membranen. Vaskemiddelmolekylerne fjernes efterfølgende (langsomt) ved tilsætning af aktiverede polystyrenperler, hvilket resulterer i dannelsen af godt forseglede proteoliposomer. Opløselige komponenter kan derefter tilsættes vesiklerne og indkapsles via fryse-optøningscyklusser, som fanger molekylerne i membranfusionsprocessen. De opnåede vesikler er meget heterogene og mange er multilamellære. De ekstruderes derefter gennem et polycarbonatfilter med en porestørrelse på 400, 200 eller 100 nm, hvilket giver mere ensartede vesikler; Jo mindre porestørrelsen er, jo mere homogene og unilamellære er vesiklerne, men til prisen for et mindre indre volumen. Ikke-inkorporerede proteiner og små molekyler fjernes fra den eksterne opløsning ved størrelsesudelukkelseskromatografi. ProteoGUL'erne kan omdannes til vesikler i mikrometerstørrelse ved gelassisteret hævelse, og disse proteoGUL'er opsamles derefter og fanges i en mikrofluidisk chip til mikroskopisk karakterisering og manipulation. Figur 2 viser en skematisk oversigt over den fulde protokol.

Figure 2
Figur 2: Oversigt over protokollen for rekonstituering af membranproteiner og indkapsling af enzymer og vandopløselige komponenter i lipidvesikler af submikrometer (LV'er) og mikrometerstørrelse (GUV'er).

Rekonstitutions- og indkapslingsprotokollerne fungerer godt, og proteinernes funktionalitet bevares, men proteoGUL'erne og proteoGUV'erne er heterogene i størrelse. Mikrofluidiske tilgange 31,32 tillader dannelse af mikrometerstore vesikler, der er mere homogene i størrelse, men funktionel rekonstitution af membranproteiner er generelt ikke mulig, fordi resterende opløsningsmiddel i dobbeltlaget inaktiverer proteinerne. ProteoUV'erne varierer i størrelse fra 100 til 400 nm, og ved lave koncentrationer af enzymer kan indkapslingen føre til vesikler med ufuldstændige metaboliske veje (stokastiske effekter; se figur 3). LÚV'er er ideelle til at konstruere specifikke metaboliske moduler, som vist her til produktion af ATP og byggesten som G3P. Sådanne proteoGUL'er kan potentielt indkapsles i GUV'er og tjene som organellignende rum for værtsvesiklerne.

Figure 3
Figur 3: Antal molekyler pr. vesikel med en diameter på 100, 200 eller 400 nm. (A) Når de indkapslede proteiner (enzymer, prober) er i området 1-10 μM. (B) Rekonstitutionen sker ved 1 til 1.000, 1 til 10.000 og 1 til 100.000 membranproteiner pr. lipid (mol/mol). Vi antager, at molekyler er indkapslet i de angivne koncentrationer og inkorporeret i membranen ved disse protein-til-lipid-forhold. For nogle enzymer har vi set, at de binder sig til membraner, hvilket kan øge deres tilsyneladende koncentration i vesiklerne. Forkortelse: LPR = Lipid-Protein-Ratio Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generel forberedelse

  1. Kemikalier
    1. Opløs lipider (i pulverform) til 25 mg/ml i CHCl3 til fremstilling af præformede liposomer.
      BEMÆRK: Det er at foretrække at tilberede friske lipidstammer, men stamopløsningerne kan også opbevares ved -20 °C i et par uger. At arbejde med lipider i pulverform er mere præcist end at bruge lipider, der allerede er opløst i CHCl3. CHCl3 skal håndteres ved hjælp af glaspipetter og/eller sprøjter og opbevares i glasbeholdere, da CHCl3 opløser plast.
    2. Små molekyler (nukleotider, aminosyrer, fluorescensprober) opløses til indkapslingsproceduren i 50 mM KPi (buffer A, se tabel 1) og pH justeres til 7,00 ± 0,01. Opløs MgCl2 i deioniseret vand for at undgå dannelse af magnesiumphosphatudfældninger.
      BEMÆRK: Stamopløsninger kan opbevares ved -20 °C i et par uger, med undtagelse af DTT, som tilberedes frisk på forsøgsdagen.
    3. Ionoforer (f.eks. valinomycin, nigericin) opløses i enten DMSO eller EtOH ved en stamkoncentration på 100-500 μM. Opbevares ved -20 °C i et par uger; undgå fordampning.
      BEMÆRK: DMSO er ikke flygtig og foretrækkes derfor frem for EtOH. Brug glas i stedet for plastikhætteglas for at undgå vedhæftning af ionoforerne til overfladen af hætteglassene.
  2. Buffere
    1. Friske buffere tilberedes på forsøgsdagen (tabel 1). Må ikke opbevares i mere end 24 timer.
  3. Oprensning af opløselige proteiner
    1. Express ArcA, ArcB, ArcC (vi bruger en specifik variant kaldet ArcC1), PercevalHR og GlpK som beskrevet tidligere 27,28,33. Sørg for at tilsætte 10% v/v glycerol til cellelysebufferen, hvilket øger proteinernes stabilitet. De opløselige proteiner renses som beskrevet 27,28,33 og kort rapporteret nedenfor.
    2. Optø 10 ml cellelysat (~5 g vådvægt) op i et isvandsbad. I mellemtiden påføres 2 ml (1 CV) Ni2+-Sepharoseharpiks på en tyngdekraftsstrømningssøjle (20 ml kapacitet) med deioniseret vand (12 CV'er) og buffer B (4 CV'er) til vask. Overfør det optøede lysat til is; arbejde på is, medmindre andet er angivet.
    3. Tilsæt imidazol til en endelig koncentration på 10 mM til det optøede lysat, og hæld derefter opløsningen på tyngdekrafts-flow-søjlen. Inkuber i 1 time ved 4 °C med forsigtig nutering.
    4. Efter 1 time kasseres gennemstrømningen og vaskes harpiksen med buffer C (20 CV'er).
    5. Eluer proteinet med Buffer D. Brug 60% CV til det første elueringstrin, efterfulgt af 4-6 trin med 40% CV'er.
    6. Bestem proteinkoncentrationen og tilsæt Na-EDTA til en endelig koncentration på 5 mM.
    7. Centrifuger det rensede protein i en kølecentrifuge (maks. hastighed, 10 minutter, 4 °C). Oprens ved størrelseseksklusionskromatografi ved hjælp af buffer E. Saml elueringsfraktionerne og koncentrer dem til ~10 mg/ml med et koncentrerende filter med en afskæring på 30 kDa. Forbered alikvoter af passende størrelse (~ 20 μL), lynfrys med flydende nitrogen og opbevar ved -80 °C til senere brug.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at koncentrere enzymerne til 50-100 μM for at minimere det volumen, der er nødvendigt for indkapslingen.
  4. Oprensning af membranproteiner
    1. Overekspres ArcD og GlpT som beskrevet tidligere 22,27,33. Sørg for at tilføje 10% v/v glycerol til cellelysebufferen; til rensning af ArcD skal der medtages 2 mM reduktionsmiddel (f.eks. DTT) i bufferen. Oprens de affinitetsmærkede proteiner ved Ni2+-Sepharose-kromatografi.
      1. Optø en alikvot af rå membranvesikler (10-20 mg totalt membranprotein) i et isvandsbad.
        BEMÆRK VENLIGST: Når den er optøet, skal du altid arbejde på is, medmindre andet er angivet. Se tabel 1 for de buffere, der anvendes i dette afsnit.
      2. Tilsæt membranvesiklerne til Buffer F (ArcD) eller Buffer G (GlpT) til et endeligt volumen på 6 ml. Prøven inkuberes i 1 time ved 4 °C med forsigtig nutering.
      3. De opløselige membranproteiner adskilles fra membranaffaldet ved ultracentrifugering (337.000 × g, 30 min, 4 °C). I mellemtiden påføres 0,25 ml (1 CV) Ni2+-sepharoseharpiks på en tyngdekraftsstrømningssøjle (10 ml kapacitet) med deioniseret vand (40 CV'er) og 20 CV'er buffer H (ArcD) eller buffer I (GlpT).
      4. Hæld det opløselige protein på tyngdekraftsstrømningssøjlen og tilsæt imidazol til en slutkoncentration på 10 mM. Inkuber i 1 time ved 4 °C med forsigtig nutring.
      5. Efter 1 time kasseres gennemstrømningen og vaskes harpiksen med 20 CV'er buffer J (ArcD) eller buffer K (GlpT).
      6. Eluer membranproteinet i trin på 60 % CV (1st) og 40 % CV (2nd-6 th) med Buffer L (ArcD) eller Buffer M (GlpT).
      7. Bestem proteinkoncentrationen og fortsæt til pkt. 2.2. til membranrekonstitution.
        BEMÆRK: Størrelsesudelukkelsesrensningen udføres ikke nødvendigvis for membranproteiner, da membranrekonstitutionen giver en lignende oprensning. Trin 1.4 og 2.2 kan udføres på 1 arbejdsdag. Start med proteinoprensning (trin 1.4) om morgenen og fortsæt med rekonstitution (trin 2.2) om eftermiddagen. Rekonstitutionen afsluttes den følgende dag (se pkt. 2.2 for detaljer). STOPPUNKT: Renset og DDM-opløselig ArcD og GlpT kan opbevares ved -80 oC til senere brug, men dette gælder ikke for alle membranproteiner. Der fremstilles alikvoter af passende størrelse (50-200 μL), lynfryses med flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C til senere brug. Disse proteiner er aktive i flere måneder, når de opbevares ved -80 °C i nærvær af 10 % v/v glycerol.
  5. Fremstilling af β-kasein til passiveringsformål
    1. Resuspender 100 mg β-kasein i 20 ml deioniseret vand og titrer med 1 M NaOH, indtil β-kasein er helt opløst. Tilsæt derefter 1 M eddikesyre for at justere pH til 7.0 og fyld volumen til 50 ml med deioniseret vand. Filtrer opløsningen gennem et 0,2 μm sprøjtefilter og lav alikvoter på 500 μL.
      BEMÆRK β-kaseinet kan opbevares ved -20 °C i 6 måneder. Det anbefales at filtrere β-kaseinet igen før brug for at undgå, at β-kaseinaggregater tilstopper mikrofluidchippen.

Buffer Sammensætning
Buffer A 50 mM KPi pH 7,0
Buffer B 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glycerol, 10 mM imidazol, pH 7,5
Buffer C 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glycerol, 50 mM imidazol, pH 7,5
Buffer D 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glycerol, 500 mM imidazol, pH 7,5
Buffer E 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10% v/v glycerol, pH 7,0
Buffer F 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,5% w/v DDM, 10% v/v glycerol, 2 mM β-mercaptoethanol, pH 7,5
Buffer G 50 mM Tris-HCl, 0,5% w/v DDM, 20% v/v glycerol, pH 8
Buffer H 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,02% w/v DDM, 10% v/v glycerol, 2 mM β-mercaptoethanol, 10 mM imidazol, pH 7,5
Buffer I 50 mM Tris-HCl, 0,04% w/v DDM, 20% v/v glycerol, 10 mM imidazol, pH 8,0
Buffer J 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02% w/v DDM, 10% v/v glycerol, 2 mM β-mercaptoethanol, 50 mM imidazol, pH 7,5
Buffer K 50 mM Tris-HCl, 0,04% w/v DDM, 20% v/v glycerol, 50 mM imidazol, pH 8
Buffer L 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02% w/v DDM, 10% v/v glycerol, 2 mM β-mercaptoethanol, 500 mM imidazol, pH 7,5
Buffer M 50 mM Tris-HCl, 0,04% w/v DDM, 20% v/v glycerol, 500 mM imidazol, pH 8
Buffer N 50 mM KPi, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0
Buffer O 50 mM KPi, 0,5 mM L-ornithin, 10 mM Na-ADP, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, pH 7,0
Buffer P 50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, x mM glukose (x varieres for at matche osmolariteten af det eksterne og interne medium)
Buffer Q 50 mM KPi pH 7,0, 0,5 mM Saccharose, 2 mM DTT
Buffer R 50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, 10 mM L-arginin, x mM glukose

Tabel 1: Buffere, der anvendes i denne protokol.

2. Proteoliposomer: rekonstitution af rensede membranproteiner til præformede lipidvesikler

  1. Dag 1
    1. Fremstilling af præformede lipidvesikler
      1. Vælg lipidsammensætningen (f.eks. syntetiske fosfolipider, E. coli polære lipider) på baggrund af membranproteinernes krav.
        BEMÆRK: En blanding af DOPE, DOPG og DOPC (25:25:50 mol%) er et godt udgangspunkt, men steroler eller cardiolipin kan være påkrævet for nogle proteiner; For gærplasmamembranproteiner inkluderer vi palmitoyl-oleoyllipider i stedet for dioleoyl30. En blanding af DOPE, DOP og DOPC (25:25:50 mol%) er tilstrækkelig til rekonstitution af ArcD og GlpT.
      2. Bland de ønskede lipider (opløst i CHCl3) og inddamp CHCl3 i en roterende fordamper, indtil der dannes en lipidfilm. Lipiderne vaskes ved at tilsætte diethylether i samme volumen som CHCl3. Inddamp diethyletheren og opnå en tør lipidfilm.
      3. Resuspender lipidfilmen til 20 mg/ml af de samlede lipider i vandige medier (buffer A). Start med halvdelen af det samlede volumen og ryst forsigtigt; Overfør derefter forsigtigt lipiderne til et rent rør eller flaske af passende størrelse. Tilsæt frisk buffer A til kolben, og gentag proceduren for at opløse de resterende lipider og overføre dem til en ny beholder. Tilsæt yderligere buffer A for at nå en endelig koncentration på 20 mg/ml.
      4. Soniker de resuspenderede lipider ved hjælp af en sondesoniker. Brug følgende parametre til en sonikerspids med en diameter på 6 mm: 4 μm intensitet, 70% amplitude, 5 s tændt, 45 s slukket, 16 cyklusser. Nedsænk lipiderne i et isvandsbad indeholdende EtOH for at undgå overophedning ved sonikering.
      5. Flash-frys den sonikerede prøve (volumen på 40 ml i et 50 ml centrifugerør) i flydende nitrogen, og tø prøven op i et vandbad ved stuetemperatur. Gentag én gang; derefter alikvoter liposomerne i ønskede mængder (f.eks. 1 ml eller 20 mg samlede lipider i et 1,5 ml plastikrør).
        STOPPUNKT: Proceduren kan stoppes på dette tidspunkt. Lynfrys hver alikvot igen (tredje cyklus) og opbevar i flydende nitrogen i op til et par måneder. Sørg for at gennembore rørets låg to gange med en nål for at undgå eksplosion af røret ved hurtig kogning af det flydende nitrogen.
  2. Dag 2
    1. Rekonstitution af rensede membranproteiner til præformede liposomer
      1. Optø en alikvot liposomer (20 mg lipider i alt) i et vandbad ved stuetemperatur. I mellemtiden skal du forberede en ekstruder ved at anvende et filter efter eget valg (f.eks. Polycarbonat, porediameter på 400 nm); præ-ligevægt ekstruderen med buffer A; og læg de optøede liposomer ('mælkeagtig opløsning") i ekstruderen og før dem 13 gange gennem filteret. Saml de ekstruderede liposomer (nu store unilamellære vesikler; "uigennemsigtig opløsning") i en glas- eller plastbeholder af passende størrelse (f.eks. 15 ml). Liposomerne fortyndes til 4 mg/ml med buffer A suppleret med 2 mM DTT.
      2. Overfør 1 ml 4 mg/ml liposomer til en 1 ml gennemsigtig kuvette. I et spektrofotometer måles den indledende optiske tæthed ved 540 nm. Hæld den målte prøve tilbage og tilsæt 50 μL 10% v/v Triton X-100 til liposomerne.
        BEMÆRK VENLIGST: Et titreringsvolumen på 50 μL 10% Triton-X100 er velegnet til 20 mg lipider i et volumen på 5 ml; tilsætningen af Triton X-100 vil fortynde lipiderne med ~5%. Juster titreringsvolumen, når du arbejder med forskellige mængder liposomer. For stabile optiske tæthedssignaler titreres liposomerne med Triton X-100 ved stuetemperatur.
      3. Trin 2.2.1.2 gentages, og notér, hvornår en maksimal optisk tæthed er nået (Rsat). Fortsæt videre med titreringen, indtil en optisk tæthed på ca. 60 % Rsat er nået (figur 4). Hæld de vaskemiddel-destabiliserede vesikler tilbage i glas-/plastrøret (det endelige volumen er nu ca. 5.2 ml), overfør prøven til is, og lad den køle af.
      4. Tilsæt det eller de rensede membranproteiner til de destabiliserede liposomer for at nå et ønsket lipid-til-protein-forhold (w/w). Brug et forhold på 400:1 ned til 100:1 w/w; da både ArcD og GlpT har molekylvægte på ~55 kDa, svarer et lipid-til-protein-forhold på 400:1 w/w til ~30.000 lipider pr. protein og ~ 50 molekyler ArcD og GlpT hver pr. vesikler med en diameter på 400 nm.
        OBS: Her bruger vi 400:1 w/w, svarende til 50 μg af hvert protein pr. 20 mg lipider.
      5. Prøverne berøres ved 4 °C i 15 minutter, så membranproteinerne kan indsættes i den destabiliserede liposomale membran.
      6. For at fjerne vaskemidlet tilsættes 200 mg tørre polystyrenperler, tilberedt i henhold til producentens anvisninger. Nuter ved 4 °C i yderligere 15 min.
        BEMÆRK: En mængde på 200 mg tørre perler er velegnet til 20 mg lipider, men bør justeres, når en anden prøvestørrelse anvendes.
      7. Gentag trin 2.2.1.6 2x for i alt tre tilsætninger af polystyrenperler. Inkuber derefter natten over ved 4 °C med forsigtig nutering.
  3. Dag 3
    1. Trin 2.2.1.6 gentages. men denne gang skal du nøse ved 4 °C i 1 time.
    2. Fastgør en tom tyngdekraftsflowsøjle (10 ml kapacitet) over et tomt 6,5 ml ultracentrifugeringsrør på is. Hæld prøven i kolonnen og saml proteoliposomerne i ultracentrifugeringsrøret (perlerne bevares i kolonnen).
    3. Vask perlerne med 0,5 ml buffer A suppleret med 2 mM DTT og opsaml filtratet i ultracentrifugeringsrøret.
    4. Koncentrer proteoliposomerne ved ultracentrifugering (337.000 × g, 30 min, 4 oC). Resuspender proteoliposomerne i et samlet volumen på 200 μL (100 mg lipid/ml) i buffer A suppleret med 2 mM DTT; det tørre volumen af vesiklerne efter centrifugering er ~40 til 120 μL27. Opdelt i alikvoter af ønsket størrelse (f.eks. tre alikvoter på 6,66 mg samlede lipider).
      BEMÆRK: Afpipetteringsstørrelsen er vilkårlig, men vil påvirke pillestørrelsen i senere trin (se trin 3.2.3.1). STOPPUNKT: Proceduren kan stoppes her. Lynfrys hver alikvot og opbevar i flydende nitrogen i op til et par uger. Sørg for at gennembore rørets låg to gange med en nål for at undgå eksplosion af røret ved hurtig kogning af det flydende nitrogen.

Figure 4
Figur 4: Titrering af præformede liposomer med Triton X-100. Liposomer på 5 mg lipider/ml ekstruderes gennem et polycarbonatfilter (400 nm) i 50 mM KPi (pH 7,0) og titreres derefter med Triton X-100 (protokoltrin 2.2.1.2). Vesiklernes turbiditet måles ved A540. Pilen angiver Triton X-100-koncentrationen, hvor vesiklerne er tilstrækkeligt destabiliserede til spontan indsættelse af membranproteiner som beskrevet i19. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Indkapsling af et metabolisk netværk til ATP-genanvendelse og glycerol 3-P-syntese i vesikler i submikronstørrelse

  1. Dag 1
    1. Blanding af komponenter
      1. Til en standardindkapsling skal du bruge 66,6 μL proteoliposomer i et slutvolumen på 200 μL (33,33 mg/ml samlede lipider). Beregn volumenet af hver komponent (enzym, cofaktor), der er nødvendig for at nå den ønskede koncentration, tilsæt disse komponenter til proteoliposomerne, og juster volumenet til 200 μL med buffer A (tabel 2).
        BEMÆRK VENLIGST: Proteinkoncentrationen kan justeres baseret på den eksperimentelle opsætning. Man skal dog være opmærksom på, at der i gennemsnit er flere kopier (>10) af hvert enzym pr. vesikel for at undgå uønskede stokastiske virkninger. Koncentrationer > 1 μM er generelt sikre; 1 μM i en vesikel med en diameter på 400 nm svarer til ca. 20 kopier (figur 3).
      2. Pipettebuffer A i et tomt 1,5 ml rør, og tilsæt DTT, Na-ADP, MgCl2, L-ornitin (og pyranin, hvis det er nødvendigt til interne pH-målinger). Tilsæt derefter enzymerne og bland forsigtigt. Tilsæt opløsningen oven på de præformede proteoliposomer, og hvirvel kort ved lav hastighed.
        BEMÆRK VENLIGST: Det er vigtigt at tilføje Na-ADP før MgCl2 for at undgå uønsket dannelse af magnesiumphosphatudfældninger. Vortexing er påkrævet for korrekt blanding af den viskøse opløsning; minimer dog varigheden og hastigheden for at undgå mekanisk skade på proteinerne. PercevalHR og pyranin kan ikke indkapsles sammen, fordi deres spektre overlapper hinanden.
    2. Bestemmelse af intern osmolalitet
      1. Der fremstilles en 50 μL opløsning som beskrevet i trin 3.1.1.1, men uden proteolipasomer, og osmolaliteten måles med et frysepunktsosmometer.
      2. Der udarbejdes en kalibreringskurve ved hjælp af buffer (50 mM KPi pH 7,0) og varierende koncentrationer af salt (f.eks. NaCl eller NaCl) eller sukker. Bestem osmolytkoncentrationen, der matcher den interne osmolalitet (buffer N).
        BEMÆRK VENLIGST: Membrangennemtrængelige komponenter (f.eks. glycerol) kan ikke bruges til at matche den interne osmolalitet. For proteiner opløst i glycerolholdig buffer (f.eks. Buffer E) bør den samme buffer anvendes uden glycerol. Den osmolyt, der vælges til fremstilling af en iso-osmotisk ekstern buffer, skal være membranuigennemtrængelig og ikke forstyrre det metaboliske netværk.
    3. Frys-optøning
      1. Proteoliposomerne lynfryses (i flydende nitrogen) sammen med de opløselige bestanddele, og optøes i et vand-isbad ved ca. 10 °C.
      2. Gentag trin 3.1.3.1 i alt 5 gange.
        STOPPUNKT: Proceduren kan stoppes her. Spring det sidste optøningstrin over, og opbevar den frosne prøve i flydende nitrogen i 1-3 dage. Sørg for at gennembore rørets låg 2 gange med en nål for at undgå eksplosion af røret ved hurtig kogning af det flydende nitrogen. Opbevaring i flydende nitrogen foretrækkes over -80 °C for at minimere lipidoxidation.
  2. Dag 2
    1. Ekstrudering
      BEMÆRK VENLIGST: Alle ekstruderingstrin udføres ved stuetemperatur, da de gastætte sprøjter ellers vil lække.
      1. Forbered en ekstruder ved at anvende et filter efter eget valg (f.eks. polycarbonat, porediameter på 400 nm). Ekstruderen vaskes med en opløsning, der indeholder den samme buffer og de samme metabolitter, der anvendes til indkapsling af vesiklerne (f.eks. buffer O plus 0,1 mM pyranin).
        BEMÆRK VENLIGST: Brug en dedikeret ekstruder til påfyldning af proteoliposomer med pyranin, da farvestoffet klæber til ekstruderens overflade og kan forårsage kontaminering i senere prøver.
      2. Læg indkapslingsblandingen i ekstruderen, og før den gennem filteret 13x. Opsaml den ekstruderede opløsning i et 1,5 ml rør.
    2. Størrelsesudelukkelseskromatografi (valgfrit)
      BEMÆRK VENLIGST: Dette trin udføres for at fjerne eksterne molekyler såsom farvestoffer som pyranin ved størrelsesudelukkelseskromatografi. Hvis der ikke er farvestoffer til stede i systemet, og andre komponenter ikke forstyrrer ved lave koncentrationer (bemærk, at vesiklerne bagefter også vaskes ved ultracentrifugering), så trin 3.2.2. kan springes over.
      1. Rehydrer Sephadex G-75-harpiks og hæld det i en glassøjle (22 cm lang, 1,5 cm bred). Sæt harpiksen i ligevægt med et overskud af ekstern buffer (f.eks. Buffer N).
      2. De ekstruderede proteolipasomer fra trin 3.2.1.2 lægges på den præækvilibrerede størrelseseksklusionskromatografikolonne, og der påføres en tyngdekraftsstrøm af ekstern buffer. Kassér det tomme volumen (ca. 7 ml); Saml derefter ti 1 ml alikvoter. Visualiser de proteoliposomholdige alikvoter ved kort eksponering for en UV-lampe. Samle fraktionerne, der indeholder de fleste proteoliposomer (2-4 ml).
    3. Vask og ophængning
      1. Vask de ekstruderede proteoliposomer ved ultracentrifugering. Fyld et 6.5 ml ultracentrifugeringsrør med 5.8 ml buffer N, og påfør den ekstruderede prøve ovenpå. Hvis der blev udført størrelseseksklusionskromatografi, fyldes røret med de samlede elueringsprøver (2-4 ml) og tilsættes buffer N til et endeligt volumen på 6 ml.
      2. Centrifuger ved 337.000 × g, 30 min., 4 °C. Kassér supernatanten, og tør ultracentrifugeringsrøret grundigt med en støvfri serviet, mens du er opmærksom på ikke at røre ved pelleten. Gensuspender pelleten i et lille volumen buffer N (200 μL). Når pillen er helt opløst, fyld røret op til 6 ml med buffer N.
        BEMÆRK VENLIGST: Det vil tage tid at ophænge pillen og bør gøres forsigtigt.
      3. Trin 3.2.3.1-3.2.3.2 gentages 2x ved i alt tre vaske, medmindre der udføres størrelsesudelukkelseskromatografi (i hvilket tilfælde et centrifugeringstrin er tilstrækkeligt). I sidste ende resuspenderes pelleten til en ønsket koncentration (f.eks. 5,55 mg/ml total lipid) ved at tilsætte et passende volumen buffer N.
        STOPPUNKT: Proteoliposomerne kan bruges med det samme eller opbevares ved 4 oC i mindst 48 timer. Størrelsen af ultracentrifugeringsrør bør vælges ud fra prøvestørrelsen. Til en pellet på 6,66 mg samlede lipider er et 6,5 ml rør passende. Vask af 200 μL proteoliposomer (33,33 mg lipider/ml i alt; tørt pelletvolumen ~40 μL)28 til 3 x 6 ml buffer fortynder de eksterne komponenter med en faktor 100 for hvert vasketrin. Hvis der anvendes rør i forskellige størrelser, er det ønskeligt at justere antallet af vaske i overensstemmelse hermed.
  3. Dag 3
    1. Påvisning af ATP-syntese ved fluorescens
      1. Reaktionskomponenterne blandes til et endeligt volumen på 120 μL (tabel 3) i en sort kvartskuvette med et vindue på 3 x 5 mm og et minimalt indvendigt volumen på 100 μL.
        BEMÆRK VENLIGST: Ionoforer kan tilsættes for at sprede elektrokemiske iongradienter. En blanding af valinomycin og nigericin (1 μM hver) spreder effektivt eventuelle proton- og kaliumgradienter.
      2. Forvarm prøven i et fluorometer indstillet til 30 °C og opnå excitationsspektre af PercevalHR (excitation 400-520 nm, båndbredde 5 nm; emission 550 nm, båndbredde 5 nm). Når sondesignalet er konstant, startes det metaboliske netværk ved tilsætning af et overskud af L-arginin (5-10 mM) og glycerol (400 μM), når genbrug af ATP er koblet til syntesen af glycerol 3-phosphat. Følg reaktionen over tid.
    2. Analyse af data
      1. Plot forholdet F500/F430 som en funktion af tiden, som er en kvalitativ indikator for ATP/ADP-forholdet. For en mere kvantitativ vurdering af ATP-dannelse skal du konstruere en kalibreringskurve i proteoliposomer eller bruge en komplementær tilgang (f.eks. ATP-kvantificering ved kemiluminescens28).
Komponent Endelig koncentration
Buffer A 50 mM KPi pH 7,0
DTT 2 mM
Na-ADP 10 mM
MgCl2 10 mM
L-ornitin 0,5 mM
Fluorescerende sonde (PercevalHR eller pyranin) henholdsvis 5,8 μM eller 0,1 mM
ArcA (Arginin deiminase) 1 μM
ArcB (Ornithin-carbamoyltransferase) 2 μM
ArcC1 (Carbamatkinase) 5 μM
GlpK (Glycerol kinase) 1,6 μM
Proteoliposomer 33,33 mg/ml lipider i alt

Tabel 2: Indkapslingskomponenter. Komponenterne er angivet i rækkefølge efter tilføjelse. Opløselige proteiner er i buffer E; alle andre komponenter (undtagen MgCl2, i deioniseret vand) er i buffer A.

Komponent Endelig koncentration
Buffer K 50 mM KPi pH 7,0, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0
Proteoliposomer (5,55 mg/ml lipider) 2,7 mg/ml lipider
Ionoforer (valinomycin, nigericin) 1 μM hver

Tabel 3: Forsøgsbetingelser. Komponenterne er angivet i rækkefølge efter tilføjelse. Proteoliposomer er i Buffer N, ionoforer i DMSO eller EtOH.

4. Opskalering af et metabolisk netværk til vesikler på størrelse med mikrometer

  1. Dag 1
    1. Forberedelse af mikrofluidisk chip
      BEMÆRK: Dette eksperiment bruger en mikrofluidisk enhed udviklet af Robinson et al.34. Andre designs af mikrofluidiske chips er tilgængelige 35,36,37 og kan nemt implementeres i denne protokol.
      1. Skær en 200 μL pipettespids en tredjedel fra bunden, og indsæt den nederste del af spidsen i en færdiglavet mikrofluidisk fangstanordning.
      2. Til chippens indløbsbeholder tilsættes 400 μL β-kaseinopløsning (2 mg/ml; se trin 1.5), og sørg for at forhindre indføring af luft på dette trin. Placer en 96-brønds pladespand og tilsæt en laboratorievæv i en bordplade konisk rørcentrifuge. Placer chippen oven på vævet og centrifuger i 6 minutter ved 900 × g for at tillade passivering af mikrofluidchippen. Efter centrifugeringstrinnet skal væskeniveauet være ens på indløbsbeholderen og udløbsspidsen af mikrofluidchippen; Kontroller for lækage af chippen. Inkuber β-kaseinopløsningen i mikrofluidchippen i mindst 30 minutter.
      3. Fjern det meste af passiveringsopløsningen uden at tilføre luft, og tilsæt 400 μl vaskebuffer (buffer P). Placer spånen på 96-brønds pladespanden og centrifuger ved 900 × g i 6 min. Lad chippen stå i vaskeopløsning indtil brug (i maksimalt 4 timer).
  2. Gelpræparat til fremstilling af proteo-GUV'er
    BEMÆRK: Følgende beskrivelse er taget og tilpasset fra 25,38.
    1. 0,5 % (w/w) af en lav-geleringstemperatur (LGT) agarose opløses i deioniseret vand ved opvarmning af opløsningen i mikrobølgeovnen; Sørg for, at agarosen er helt opløst, og undgå at koge opløsningen. Opbevar agarosen ved 50 °C indtil yderligere brug.
      BEMÆRK VENLIGST: Opløst agarose kan opbevares ved stuetemperatur i flere uger. For at genbruge agarosen skal du blot smelte gelen ved hjælp af en mikrobølgeovn.
    2. Tag to objektive dias og tegn omridset af afstandsstykket på diasene. Gør objektglassene hydrofile ved plasmarensning ved hjælp af plasma med højt iltindhold i 1 min.
    3. Tilsæt LGT-agarose oven på objektglasset, indtil det er helt dækket af agarose (~500 μL); Vip derefter objektglasset i en vinkel på 90 ° og dræn overskydende agarose på et væv. Lad objektglassene stå i 30 minutter ved 50 °C.
    4. Tag proteoliposomer opbevaret i flydende nitrogen (afsnit 3) og tø op på is. Fortynd vesiklerne til 5 mg/ml lipider ved hjælp af buffer Q.
      BEMÆRK: Proteoliposomer fremstillet i punkt 3 indeholder ikke opløselige proteiner og kan fremstilles i god tid, hvis de opbevares i flydende nitrogen. Når du arbejder med proteoGUV'er, skal du sørge for altid at filtrere arbejdsopløsningerne for at forhindre tilstopning af den mikrofluidiske enhed.
    5. Soniker proteo-liposomerne ved hjælp af en håndholdt sonde sonicator med en 1 mm sonde. Soniker i 10 cyklusser med 0,5 s tændt og 0,5 s slukket ved 70% amplitude. Hold vesiklerne, herefter benævnt proteoSUV'er, på is i 30 sekunder, og gentag sonikeringsprocessen 5x.
    6. Fyld en 100 μL sprøjte (i en håndholdt LCP-dispenser) med proteo-SUV-affjedringen. Afsæt 0,5 μL dråber af proteo-SUV'er på den tidligere forberedte agarosegel; Pas på ikke at forstyrre agaroselaget og holde tilstrækkelig afstand til at forhindre dråber i at smelte sammen.
      BEMÆRK Brug af en håndholdt LCP-dispenser tillader dråbeaflejring på en reproducerbar måde, men alternative pipetteringssystemer kan også bruges. Pletblødning med en glaskapillær er mindre egnet, fordi det forstyrrer den tørrede agarosegel.
    7. Tør SUV-dråberne på ~10 minutter ved hjælp af en nitrogenstrøm i stedet for trykluft for at reducere muligheden for at oxidere lipiderne.
    8. Forbered 1 ml af en 1,25x koncentreret buffer O (tabel 4) i buffer A og passere gennem et 0,2 μm celluloseacetatfilter. Tag 800 μL af den 1,25x koncentrerede opløsning og tilsæt de opløselige enzymer og sonder til en koncentration som angivet i tabel 4. Brug filtreret deioniseret vand til at gøre det endelige volumen 1 ml.
    9. Forbered 100 μL hævelsesopløsning indeholdende alle bestanddele i tabel 4, undtagen proteiner og glycerol. Mål osmolaliteten af hævelsesopløsningen ved hjælp af et 3-punkts kalibreret frysepunktsosmometer.
      BEMÆRK VENLIGST: Forbered 100 μL hævelsesopløsning uden protein og glycerol for nøjagtigt at bestemme osmolaliteten af denne opløsning. Glycerol, som er til stede i proteinopløsningen, påvirker osmolaliteten, men i GUV'er diffunderer glycerol hurtigt over membranen og fører kun til forbigående osmotiske forskelle.
    10. Saml GUV-hævekammeret ved at lave en sandwich af to objektivglas indeholdende gelen og tørrede SUV'er med et 1,5 eller 3,0 mm tykt teflonafstandsstykke imellem. Tilsæt derefter hævelsesopløsningen i kammeret gennem det lille hul i siden ved hjælp af en sprøjte og nål.
      BEMÆRK VENLIGST: Hævelsesopløsningens volumen kan justeres ved at variere afstandsstykkerne fra 1.5 til 3.0 mm.
  3. Hævelse af vesikler og høst af GUV'er
    1. Vask hæves ved at anbringe kammeret ved 22 °C i mindst 30 minutter.
      BEMÆRK VENLIGST: Hævelsen af vesiklerne kan efterfølges af lysmikroskopi (f.eks. et bordfasekontrastmikroskop eller et widefield fluorescensmikroskop), hvis proteinerne eller lipiderne er fluorescerende mærket.
    2. Høst GUV'erne fra gelen ved at påføre blid fysisk omrøring ved at banke kammeret på en fast overflade (f.eks. Laboratoriebænk); tag en tredjedel af volumenet ud og brug den resulterende luftboble til forsigtigt at fremkalde bevægelse til den resterende væske og derved løsne GUV'erne fra gelen.
    3. Mens GUV'erne svulmer op, skal du forberede buffer P og matche osmolaliteten med hævelsesopløsningen ved at justere koncentrationen af glukose. Filtrer bufferen gennem et 0,2 μm sprøjtefilter.
      BEMÆRK VENLIGST: Generelt bør vaske- og substratopløsningen holdes inden for ± 5 mosmol/kg. Enhver opløsning, der passerer gennem chippen, skal være meget ren, da forurenende stoffer kan tilstoppe kanalerne. Lav friske buffere hver gang eller opbevar forberedte buffere ved -20 °C og filtrer før brug.
  4. Fældning af GUV'er til mikroskopieksperimenter
    1. Monter den passiverede mikrofluidiske chip på prøvetrinnet i mikroskopet. Kontroller for mulige defekter (f.eks. utætheder, indespærret luft, tilstoppede kanaler).
      BEMÆRK VENLIGST: Kontrol af chippen kan udføres i god tid før brug, så en ny chip kan tilberedes, hvis det er nødvendigt.
    2. Tilslut slangen ved hjælp af en bøjet nål til udløbet af reservoiret, og tilslut den anden ende til en 1 ml sprøjte. Monter sprøjten på en pumpe, og indstil flowhastigheden til maksimalt 10 μL/min.
    3. Tag vaskebufferen ud af beholderen (trin 4.1.1.3) og udskift den med frisk medium (buffer P). Start strømmen af buffer gennem chippen ved at infundere via sprøjten ved 1-10 μL/min. Vask med mindst 80 μL osmotisk afbalanceret vaskebuffer (Buffer P).
    4. Fjern overskydende vaskebuffer fra reservoiret, og tilsæt (proteo)GUV'erne til reservoiret. Juster flowhastigheden til 0.1-1 μL/min for at tillade GUV'erne at strømme gennem chippen. Overvåg chippen over tid, indtil nok GUV'er er blevet fanget i chippen.
      BEMÆRK: Vesikler med relativt store mængder (>20 mol%) af ladede lipider såsom phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylserin (PS) eller phosphatidinsyre (PA) eller ikke-dobbeltlagsdannende lipider som phosphatidylethanolamin (PE) indføres med en lavere strømningshastighed gennem chippen for at forhindre sprængning. Vesikler sammensat af ren phosphatidylcholin (PC) har tendens til at være mere stabile.
    5. Fjern overskydende GUV-opløsning og tilsæt vaskebuffer P ved hjælp af en konstant strøm på 0,1-1 μL/min for at udskifte det eksterne medium og vaske de fangede GUV'er i mindst 1 time for at fjerne ikke-indkapslede forbindelser og sænke baggrundsfluorescensen, når en fluorofor er indkapslet. Overvåg baggrundsfluorescensen over tid; Hvis baggrundsfluorescensen ikke falder, kan chippen blive blokeret.
    6. Lokaliser fælder med tilstrækkelige mængder vesikler og gem deres positioner. Anvend indstillingerne på mikroskopet (f.eks. laserintensitet, forstærkning, bølgelængde) og start et tidsserieeksperiment.
    7. Tilsæt osmotisk afbalanceret substratopløsning (buffer R) til reservoiret og start en strømningshastighed på 0,5 μL/min.

Buffer L-komponenter
Komponent 1,25 x koncentration Arbejdsmæssig koncentration
Buffer A 62,5 mM KPi pH 7,0 50 mM KPi pH 7,0
Saccharose 125 mM 100 mM
DTT 2,5 mM 2 mM
Na-ADP 12,5 mM 10 mM
MgCl2 12,5 mM 10 mM
L-ornitin 0,625 mM 0,5 mM
Indkapsling komponenter
Pyranin eller PercevalHR 1 mM eller 20 μM
ArcA (Arginin deiminase) 1 μM
ArcB (Ornithin-carbamoyltransferase) 2 μM
ArcC1 (Carbamatkinase) 5 μM

Tabel 4: Buffer O og indkapslingskomponenter. Komponenterne er angivet i rækkefølge efter tilføjelse. Alle komponenter (undtagen MgCl2, i deioniseret vand) er i buffer A. Indkapslingskomponenter er angivet i rækkefølge efter tilsætning. Alle vandopløselige proteiner er i buffer E.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rekonstitution af opløselige membranproteiner i liposomer kræver destabilisering af præformede vesikler. Tilsætningen af lave mængder Triton X-100 resulterer i første omgang i en stigning i absorbansen ved 540 nm (A540) på grund af en stigning i lysspredning ved hævelse af vesiklerne (figur 4). Den maksimale A540-værdi er det punkt, hvor liposomerne er mættet med vaskemiddel (Rsat), hvorefter enhver yderligere tilsætning af Triton X-100 vil resultere i delvis opløselighed af vesiklerne. Ved Rsol er liposomerne fuldstændigt opløselige (figur 4). Til rekonstituering af membranproteiner bruger vi typisk vesikler destabiliseret til 60 % ud over Rsat (angivet med pil).

Det rekonstituerede membranprotein ArcD bruges til at transportere L-arginin ind i og L-ornitin ud af vesiklerne og bruges sammen med de indkapslede enzymer ArcA, ArcB og ArcC til at genbruge ATP fra ADP og uorganisk phosphat. GlpT er en glycerol 3-phosphat/phosphat-antiporter, der sammen med GlpK er nødvendig for syntese (og udskillelse) af glycerol-3-phosphat fra glycerol plus ATP produceret ved L-arginin-nedbrydningen. Tilsætningen af 5 mM L-arginin ved t = 0 til proteoliposomerne resulterer i en stejl stigning i forholdet mellem PercevalHR-fluorescensen ved 500 og 430 nm excitation39, hvilket afspejler ATP/ADP-forholdet inde i vesiklerne (figur 5). Ved tilsætning af glycerol anvendes ATP til syntese af glycerol 3-phosphat, hvilket resulterer i en sænkning af ATP/ADP-forholdet28. Nedbrydningen af L-arginin fører også til pH-ændringer, som kan kvantificeres ved hjælp af pyranin eller pHluorin27.

Figure 5
Figur 5: Genanvendelse af ATP ved L-arginin-nedbrydningsvejen. LUV'er ved 2,7 mg lipid/ml placeres i en kuvette, og forholdet mellem fluorescens ved 500 nm og 430 nm registreres. 5 mM L-arginin tilsættes ved t = 0. F500/F430-forholdet er et mål for ATP/ADP-forholdet inde i vesiklerne. Forkortelse: LUVs = store-unilamellære vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.

De ATP-producerende UV'er kan også bruges til at danne GUV'er. Rehydrering af tørrede proteo-LUV'er på en LGT-agarosegel resulterer i dannelsen af mikrometerstore vesikler (figur 6). Dannelsen af proteo-GUV'er i de tørrede LUV-pletter afhænger i høj grad af den lokale koncentration af lipider og graden af dehydrering. Nogle områder har store pletter af GUV'er, mens der andre steder i samme dråbe kan dannes ingen eller få GUV'er. Dannelsen af GUV'er via LGT-agarose-assisteret hævelse resulterer i en række GUV-størrelser, typisk fra et par mikrometer til mere end 50 μm.

Figure 6
Figur 6: DIC-billeder af proteoGUV'er dannet af gelassisteret hævelse. Skalabjælke = 25 μm. Forkortelser: DIC = differentiel interferenskontrast; GUV'er = gigantiske-unilammellære vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.

GUV'erne høstes og fanges i en β-kaseinpassiveret PDMS-baseret mikrofluidisk enhed (figur 7). Enheden er designet på en måde, så mange vesikler kan fanges og analyseres i et enkelt eksperiment, og enheden bruges til at kontrollere det eksterne miljø (flowhastighed, buffersammensætning osv.) 34. Selv når udbyttet af proteo-GUV'er er lavt, gør den konstante strøm af GUV'er gennem mikrofluidchippen det muligt at opsamle mange vesikler. Når nok GUV'er er fanget, vaskes systemet med en osmotisk afbalanceret buffer for at fjerne eksterne komponenter såsom opløselige proteiner, små molekyler og fluorescerende sonder. Vaskebufferen erstattes derefter af en substratopløsning med samme osmolalitet indeholdende 50 mM KPi (pH 7,0), varierende mængder glukose (for at justere osmolaliteten) og substrater såsom 10 mM L-arginin. Et tidsserieeksperiment udføres på flere fælder af mikrofluidikchippen, og billeder tages hvert 90. sekund (405 nm og 488 nm excitation, når PercevalHR bruges). Yderligere tages et lysfeltbillede på hvert tidspunkt. Forholdet mellem emissionsintensiteterne efter excitation ved 488 og 405 nm er et mål for ADP/ATP-forholdet i vesiklerne.

Figure 7
Figur 7: Indfangning af vesikler med mikrofluidchippen. (A) Indfangning af vesiklerne, ledsaget af evnen til at kontrollere det ydre miljø og strømningshastigheden. (B) ProteoGUV'er fanget i en mikrofluidisk enhed og exciteret med en 405 nm laser (grøn) og 488 laser (rød). Emissionen for begge kanaler måles ved >500 nm. Brightfield-billedet giver mulighed for visualisering af vesiklerne uden fluorescens. Skalabjælke = 25 μm. Forkortelse: GUV'er = kæmpe-unilamellære vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi præsenterer en protokol for syntese af (membran)protein, der indeholder lipidvesikler i submikrometerstørrelse (proteoGUL'er), og omdannelse af proteoLÚV'er til gigantiske unilamellære vesikler (proteoGUV'er). Protokollen bør gælde for rekonstitution af andre membranproteiner 13,19,30,40 og indkapsling af andre metaboliske netværk end L-arginin-nedbrydningen og glycerol-3-phosphatsyntesevejene, der er præsenteret her.

Rekonstitutionen af membranproteiner i liposomer giver generelt en tilfældig orientering af proteinerne i lipidmembranen. For ArcD og Gglpt betyder orienteringen ikke noget, fordi proteinerne fungerer tovejs, og de opløste stoffer bevæger sig afhængigt af tegnet på det samlede elektrokemiske potentiale. For proteiner, der fungerer i én retning, vil halvdelen af molekylerne ikke være tilgængelige for aktivitet, når deres orientering er 50/50.

Ekstruderingen af vesikler gennem et polycarbonatfilter indsnævrer størrelsesfordelingen, og vesiklerne bliver mere homogene, jo mindre filtrenes porestørrelse er. Mindre vesikler kommer dog på bekostning af at have et mindre volumen og dermed et meget lille antal proteiner (enzymer, membranproteiner) pr. vesikel. For at minimere fraktionen af LUV'er, hvor en eller flere komponenter mangler, kan koncentrationen af proteinerne justeres som vist i figur 3A,B, men med meget små vesikler er stokastiske virkninger uundgåelige.

Den gel-assisterede hævelsesmetode er afhængig af aflejring af sonikerede vesikler (SUV'er) på en tørret agaroseoverflade. Under tørringsprocessen dannes en koncentrationsgradient af vesikler, og lipidkoncentrationen er den højeste i periferien af stedet. Dette skyldes et fænomen kendt som kaffepleteffekten41,42. Som et resultat indeholder kun et lille område på stedet en koncentration af lipider, der er egnede til GUV-dannelse. Cirkulære ujævnt koncentrerede lipidpletter resulterer i store ubrugte områder, der ikke er tilgængelige for vesikelfusion; derfor bliver effektiviteten af GUV-dannelse lav i denne tilgang. For at øge udbyttet af GUV'er bør man sigte efter en ensartet lipidaflejring, som kan opnås ved at centrifugere belægning42 eller udnytte kaffepleteffekten41.

Yderligere bemærkninger til protokollen:

Der skal udvises omsorg for, at flere membranproteiner (>10) rekonstitueres i gennemsnit pr. vesikel for at undgå stokastiske virkninger. Undgå derfor lipid-til-protein-forhold højere end 400:1 w/w. En tilfældig orientering antages for de fleste proteiner.

Ideelt set er volumenet af samlede membranproteiner så lille som muligt og overstiger alligevel ikke 10-20% af liposomvolumenet. Tilsætning af større mængder vil introducere mere vaskemiddel, og størstedelen af præformede liposomer kan lysere, hvilket kan have en negativ effekt på rekonstitueringseffektiviteten.

Præ-ligevægt af ekstruderen med den passende opløsning er vigtig for at undgå fortynding af komponenterne under indkapslingen. Ideelt set bør præligevægtsopløsningen også indeholde de opløselige enzymer, men det kan være for dyrt at inkludere enzymer på grund af det relativt store volumen, der er nødvendigt for præ-ligevægt af ekstruderen. Derfor udelader vi typisk disse komponenter og accepterer en 5% fortynding af enzymerne.

Ionoforer bør tilsættes til blandinger, der indeholder proteoliposomer, fordi molekylerne er meget hydrofobe og kan adsorbere til overflader, hvis vesikler ikke er til stede. Det skal sikres, at mængden af tilsat solvens er lav (<1 % af det samlede reaktionsvolumen). Kontroller udføres for at verificere, at opløsningsmidlerne ikke påvirker de metaboliske netværk i vesiklerne. Ionoforkoncentrationer på ca. 1 μM er generelt sikre for totale lipidkoncentrationer på ~3 mg/ml.

Sørg for at tørre dråberne grundigt. Hvis dråberne ikke er tørre nok, er GUV-dannelsen mindre effektiv, da lipider vil danne lipidaggregater, og MLV'er kan dannes, når hævelsesopløsningen tilsættes.

Glukose bruges til at matche osmolariteten af det ydre til det indre medium; sidstnævnte indeholder saccharose i stedet for glukose for at øge tætheden af vesiklerne og derved lette sedimenteringen af GUV'erne. Desuden forbedrer glukose i det ydre miljø fasekontrasten, hvilket gør vesiklen lettere synlig.

Stokastiske effekter er meget mindre af et problem med GUV'er; Men her kan forholdet mellem overflade og volumen blive uacceptabelt lavt, således at antallet af membranproteiner (f.eks. transportører) bliver begrænsende for det interne metaboliske netværk. Metoden beskrevet i denne protokol tillader ikke præcis kontrol over størrelsen af proteoGUV'erne, men størstedelen falder inden for størrelsesområdet 5-50 μm.

Afslutningsvis giver det arbejde, der præsenteres her, et omfattende overblik over membranproteinrekonstitution og enzymindkapsling i lipidvesikler af varierende størrelse. Vi demonstrerer konstruktionen af funktionelle vesikler til syntese af ATP og byggesten fra simple forløbere som aminosyrer og glycerol. Rekonstituering af membranproteiner i GUV'er er fortsat udfordrende, men de her præsenterede protokoller baner vejen for yderligere udvikling inden for bottom-up syntetisk biologiforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Aditya Iyer for kloningen af pBAD-PercevalHR-genet og Gea Schuurman-Wolters for at hjælpe med proteinproduktion og oprensning. Forskningen blev finansieret af NWO Gravitation-programmet "Building a Synthetic Cell" (BaSyC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Aldrich A9414-25g
Amicon cut-off filter Sigma Aldrich Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra 
BioBeads BioRad 152-3920
CHCl3 Macron Fine Chemicals MFCD00000826
D(+)-Glucose Formedium -
D(+)-Sucrose Formedium -
DDM Glycon D97002 -C
Diethyl Ether Biosolve 52805
DMSO Sigma-Aldrich 276855-100ml
DOPC Avanti 850375P-1g
DOPE Avanti 850725P-1g
DOPG Avanti 840475P-1g
DTT Formedium  DTT005
EtOH J.T.Baker Avantor MFCD00003568
Extruder Avestin Inc LF-1
Fluorimeter Jasco Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol BOOM 51171608
Gravity flow column Bio-Rad 732-1010
Hamilton syringe 100 µL Hamilton 7656-01
Hamilton syringe 1000 µL Hamilton 81320
Handheld LCP dispenser Art Robbins Instruments 620-411-00
Handheld Sonicator Hielscher Ultrasound Technology UP50H
HCl BOOM x76021889.1000
Imidazole Roth X998.4-250g
K2HPO4 Supelco 1.05099.1000
KCl BOOM 76028270.1
KH2PO4 Supelco 1.04873.1000
Kimwipe Kimtech Science 7552
Large Falcon tube centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006-100G
Light microscope Leica DM LS2
L-Ornithine Roth T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670-1KG
Microfluidic chip Homemade  PDMS based DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP Sigma-Aldrich A2754-1G
NaCl Supelco 1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer Isogen Life Science ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH Supelco 1.06498.1000
Needles for GUVs Henke-Ject 14-14575 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics Henke-Ject 14-15538 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose Cytiva 17526802
Nigericin Sigma-Aldrich N7143-5MG
Nutator VWR 83007-210
Osmolality meter Gonotec Salmenkipp Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner Plasma Etch PE-Avenger
Polycarbonate filter Cytiva Whatman Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 355647
Pyranine Acros Organics H1529-1G
Quartz cuvette (black) Hellma Analytics 108B-10-40
Sephadex G-75 resin  GE Healthcare 17-0050-01
Sonicator Sonics Sonics & Materials INC Sonics vibra cell
Syringe filter Sarstedt Filtropur S plus 0.2 0.2 µm
Syringe pump Harvard Apparatus A-42467
Tabletop centrifuge Eppendorf centrifuge 5418
Teflon spacer Homemade  Teflon based 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris PanReac AppliChem A1086.1000
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100 ml
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima Max-E
UV lamp Spectroline ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer Jasco V730 spectrophotometer
Valinomycin Sigma-Aldrich V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope Zeiss AxioObserver
β-Casein Sigma Aldrich C5890-500g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
  2. Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges. Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).
  3. Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. Industrial biomanufacturing: The future of chemical production. Science. 355 (6320), (2017).
  4. Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design. Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).
  5. Wang, A., et al. Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168 (2020).
  6. Kanter, G., et al. Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines. Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).
  7. Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).
  8. Jain, K. K. Synthetic biology and personalized medicine. Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).
  9. Schwille, P., Frohn, B. P. Hidden protein functions and what they may teach us. Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).
  10. Sachsenmeier, P. Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology. Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).
  11. Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).
  12. Godoy-Hernandez, A., et al. Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions. ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).
  13. Sikkema, H. R., et al. Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA. Sci Adv. 6 (47), 7697 (2020).
  14. Foucaud, C., Poolman, B. Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport. J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).
  15. Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization. Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).
  16. Simidjiev, I., et al. Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro. Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).
  17. Harris, N. J., Booth, P. J. Folding and stability of membrane transport proteins in vitro. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).
  18. Jackson, M. L., Litman, B. J. Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).
  19. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  20. Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).
  21. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).
  22. Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1 (2023).
  23. Lee, K. Y., et al. Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system. Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).
  24. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. Methods in Enzymology. , Elsevier. 161-176 (2009).
  25. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J. Vis. Exp. (95), e52281 (2015).
  26. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  27. Pols, T., et al. A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis. Nat Commun. 10 (1), 4239 (2019).
  28. Bailoni, E., Poolman, B. ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis. ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).
  29. Van Der Heide, T. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).
  30. Van'T Klooster, J. S., et al. Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).
  31. Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations. Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).
  32. Weiss, M., et al. Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics. Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).
  33. Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown. FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).
  34. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  35. Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459 (2019).
  36. Elias, M., et al. Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette. Micro Nano Eng. 8, 100064 (2020).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 044105 (2013).
  38. Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths. Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).
  39. Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4 (1), 2550 (2013).
  40. Setyawati, I., et al. In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters. eLife. 9, e64389 (2020).
  41. Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles. Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).
  42. Estes, D. J., Mayer, M. Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).

Tags

Metaboliske netværk uden for ligevægt Membranproteinrekonstituering Store unilamellære vesikler (UV'er) Kæmpe unilamellære vesikler (GUV'er) Bioreaktorer Fluorescensbaserede sensorer Enzymindkapsling Metabolitindkapsling
Konstruktion af metaboliske netværk uden for ligevægt i vesikler i nano- og mikrometerstørrelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, … More

Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, B. Construction of Out-of-Equilibrium Metabolic Networks in Nano- and Micrometer-Sized Vesicles. J. Vis. Exp. (206), e66627, doi:10.3791/66627 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter