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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Construction de réseaux métaboliques hors équilibre dans des vésicules de taille nanométrique et micrométrique

Published: April 12, 2024 doi: 10.3791/66627
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Groningen

Summary

Nous présentons un protocole pour reconstituer les protéines membranaires et encapsuler des enzymes et d’autres composants solubles dans l’eau dans des vésicules lipidiques de taille submicrométrique et micrométrique.

Abstract

Nous présentons une méthode pour incorporer dans les vésicules des réseaux de protéines complexes, impliquant des protéines membranaires intégrales, des enzymes et des capteurs basés sur la fluorescence, en utilisant des composants purifiés. Cette méthode est pertinente pour la conception et la construction de bioréacteurs et l’étude de réseaux de réactions métaboliques complexes hors équilibre. Nous commençons par reconstituer des protéines membranaires (multiples) en grandes vésicules unilamellaires (LUV) selon un protocole préalablement développé. Nous encapsulons ensuite un mélange d’enzymes purifiées, de métabolites et de capteurs basés sur la fluorescence (protéines fluorescentes ou colorants) par congélation-décongélation-extrusion et éliminons les composants non incorporés par centrifugation et/ou chromatographie d’exclusion stérique. La performance des réseaux métaboliques est mesurée en temps réel en surveillant le rapport ATP/ADP, la concentration en métabolites, le pH interne ou d’autres paramètres par lecture de fluorescence. Nos vésicules contenant des protéines membranaires de 100 à 400 nm de diamètre peuvent être converties en vésicules unilamellaires géantes (GUV), en utilisant des procédures existantes mais optimisées. L’approche permet d’inclure des composants solubles (enzymes, métabolites, capteurs) dans des vésicules de taille micrométrique, augmentant ainsi le volume des bioréacteurs de plusieurs ordres de grandeur. Le réseau métabolique contenant les GUVs est piégé dans des dispositifs microfluidiques pour être analysé par microscopie optique.

Introduction

Le domaine de la biologie synthétique ascendante se concentre sur la construction de cellules (minimales) 1,2 et de bioréacteurs métaboliques à des fins biotechnologiques 3,4 ou biomédicales 5,6,7,8. La construction de cellules synthétiques fournit une plate-forme unique qui permet aux chercheurs d’étudier les protéines (membranaires) dans des conditions bien définies imitant celles des environnements natifs, permettant la découverte de propriétés émergentes et de fonctions biochimiques cachées des protéines et des réseaux de réactions9. En tant qu’étape intermédiaire vers une cellule synthétique fonctionnant de manière autonome, des modules sont développés qui capturent les caractéristiques essentielles des cellules vivantes telles que la conservation de l’énergie métabolique, la synthèse des protéines et des lipides et l’homéostasie. De tels modules améliorent non seulement notre compréhension de la vie, mais ont également des applications potentielles dans les domaines de la médecine8 et de la biotechnologie10.

Les protéines transmembranaires sont au cœur de pratiquement tous les réseaux métaboliques, car elles transportent des molécules à l’intérieur ou à l’extérieur de la cellule, signalent et répondent à la qualité de l’environnement et jouent de nombreux rôles biosynthétiques. Ainsi, l’ingénierie de modules métaboliques dans des cellules synthétiques nécessite dans la plupart des cas la reconstitution de protéines membranaires intégrales et/ou périphériques en une bicouche membranaire composée de lipides spécifiques et d’une grande intégrité (faible perméabilité). La manipulation de ces protéines membranaires est un défi et nécessite des connaissances spécifiques et des compétences expérimentales.

Plusieurs méthodes ont été développées pour reconstituer des protéines membranaires au sein des vésicules phospholipidiques, le plus souvent dans le but d’étudier la fonction11,12, la régulation13, les propriétés cinétiques14,15, la dépendance lipidique15,16 et/ou la stabilité17 d’une protéine spécifique. Ces méthodes impliquent la dilution rapide des protéines solubilisées au détergent dans un milieu aqueux en présence de lipides18, l’élimination des détergents par incubation de protéines solubilisées au détergent avec des vésicules lipidiques déstabilisées par le détergent et l’absorption du ou des détergents sur des billes de polystyrène19, ou l’élimination des détergents par dialyse ou chromatographie d’exclusion stérique20. Des solvants organiques ont été utilisés pour former des vésicules lipidiques, par exemple, via la formation d’interphases huile-eau21, mais la majorité des protéines membranaires intégrales sont inactivées lorsqu’elles sont exposées à de tels solvants.

Dans notre laboratoire, nous reconstituons principalement les protéines membranaires par la méthode d’absorption détergente pour former de grandes vésicules unilamellaires (LUVs)19. Cette méthode permet la co-reconstitution de plusieurs protéines membranaires et l’encapsulation dans la lumière vésiculaire d’enzymes, de métabolites et de sondes22,23. Les LUV contenant des protéines membranaires peuvent être convertis en vésicules unilamellaires géantes (GUV) avec/sans encapsulation de composants solubles dans l’eau, en utilisant soit l’électroformation24, soit le gonflement assisté par gel25 et des conditions spécifiques pour préserver l’intégrité des protéines membranaires26.

Cet article présente un protocole pour la reconstitution dans les LUV d’un réseau métabolique hors équilibre qui régénère l’ATP par la décomposition de la L-arginine en L-ornithine27. La formation d’ATP est couplée à la production de glycérol-3-phosphate (G3P), un élément constitutif important pour la synthèse des phospholipides22,28. La voie métabolique se compose de deux protéines membranaires intégrales, une arginine/ornithine (ArcD) et un antiporteur G3P/Pi (GlpT). De plus, trois enzymes solubles (ArcA, ArcB, ArcC) sont nécessaires au recyclage de l’ATP, et GlpK est utilisé pour convertir le glycérol en glycérol 3-phosphate, en utilisant l’ATP issu de la dégradation de la L-arginine, voir la figure 1 pour une vue d’ensemble schématique de la voie. Ce protocole représente un bon point de départ pour la construction future de réseaux réactionnels encore plus complexes, pour la synthèse de lipides ou de protéines ou la division des cellules. La composition lipidique des vésicules soutient l’activité d’une grande variété de protéines membranaires intégrales et a été optimisée pour le transport de diverses molécules dans ou hors des vésicules 27,29,30.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble de la voie de production de l’ATP et de la synthèse et de l’excrétion du glycérol 3-phosphate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

En bref, des protéines membranaires purifiées (solubilisées dans du dodécyl-β-D-maltoside, DDM) sont ajoutées à des vésicules lipidiques préformées qui ont été déstabilisées avec Triton X-100, ce qui permet l’insertion des protéines dans la membrane. Les molécules de détergent sont ensuite (lentement) éliminées par l’ajout de billes de polystyrène activées, ce qui entraîne la formation de protéoliposomes bien scellés. Des composants solubles peuvent ensuite être ajoutés aux vésicules et encapsulés via des cycles de gel-dégel, ce qui piège les molécules dans le processus de fusion membranaire. Les vésicules obtenues sont très hétérogènes et beaucoup sont multilamellaires. Ils sont ensuite extrudés à travers un filtre en polycarbonate avec une taille de pores de 400, 200 ou 100 nm, ce qui donne des vésicules de taille plus uniforme ; Plus la taille des pores est petite, plus les vésicules sont homogènes et unilamellaires, mais au prix d’un volume interne plus petit. Les protéines non incorporées et les petites molécules sont éliminées de la solution externe par chromatographie d’exclusion stérique. Les proteoLUV peuvent être convertis en vésicules de taille micrométrique par gonflement assisté par gel, et ces proteoGUVs sont ensuite collectés et piégés dans une puce microfluidique pour la caractérisation et la manipulation microscopiques. La figure 2 présente une vue d’ensemble schématique de l’ensemble du protocole.

Figure 2
Figure 2 : Vue d’ensemble du protocole de reconstitution des protéines membranaires et d’encapsulation d’enzymes et de composants hydrosolubles dans des vésicules lipidiques submicrométriques (LUV) et micrométriques (GUV). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les protocoles de reconstitution et d’encapsulation fonctionnent bien et la fonctionnalité des protéines est conservée, mais les proteoLUVs et les proteoGUVs sont de taille hétérogène. Les approches microfluidiques31,32 permettent la formation de vésicules de taille micrométrique de taille plus homogène, mais la reconstitution fonctionnelle des protéines membranaires n’est généralement pas possible car le solvant résiduel dans la bicouche inactive les protéines. La taille des protéoLUV varie de 100 à 400 nm, et à de faibles concentrations d’enzymes, l’encapsulation peut conduire à des vésicules avec des voies métaboliques incomplètes (effets stochastiques ; voir Figure 3). Les LUV sont idéaux pour construire des modules métaboliques spécifiques, comme le montre ici la production d’ATP et de blocs de construction comme le G3P. De tels protéoLUV peuvent potentiellement être encapsulés dans des GUV et servir de compartiments semblables à des organites pour les vésicules hôtes.

Figure 3
Figure 3 : Nombre de molécules par vésicule d’un diamètre de 100, 200 ou 400 nm. (A) Lorsque les protéines encapsulées (enzymes, sondes) sont dans la gamme de 1 à 10 μM. (B) La reconstitution se fait à 1 à 1 000, 1 à 10 000 et 1 à 100 000 protéines membranaires par lipide (mol/mol). Nous faisons l’hypothèse que les molécules sont encapsulées aux concentrations indiquées et incorporées dans la membrane à ces ratios protéines/lipides. Pour certaines enzymes, nous avons vu qu’elles se lient aux membranes, ce qui peut augmenter leur concentration apparente dans les vésicules. Abréviation : LPR = Lipid-Protein-Ratio Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de ce chiffre.

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Protocol

1. Préparation générale

  1. Produits chimiques
    1. Dissoudre les lipides (sous forme de poudre) à 25 mg/mL dans CHCl3 pour la fabrication de liposomes préformés.
      REMARQUE : Il est préférable de préparer des stocks de lipides frais, mais les solutions mères peuvent également être conservées à -20 °C pendant quelques semaines. Travailler avec des lipides sous forme de poudre est plus précis que d’utiliser des lipides déjà solubilisés dans CHCl3. Le CHCl3 doit être manipulé à l’aide de pipettes et/ou de seringues en verre et stocké dans des récipients en verre, car le CHCl3 dissout les plastiques.
    2. Dissoudre les petites molécules (nucléotides, acides aminés, sondes de fluorescence) pour la procédure d’encapsulation dans 50 mM KPi (tampon A, voir tableau 1) et ajuster le pH à 7,00 ± 0,01. Dissoudre le MgCl2 dans de l’eau déminéralisée pour éviter la formation de précipités de phosphate de magnésium.
      REMARQUE : Les solutions mères peuvent être conservées à -20 °C pendant quelques semaines, à l’exception du DTT, qui est fraîchement préparé le jour de l’expérience.
    3. Dissoudre les ionophores (p. ex. valinomycine, nigéricine) dans le DMSO ou l’EtOH à une concentration de stock de 100 à 500 μM. Conserver à -20 °C pendant quelques semaines ; éviter l’évaporation.
      REMARQUE : Le DMSO n’est pas volatil et est donc préféré à l’EtOH. Utilisez du verre plutôt que des flacons en plastique pour éviter l’adhérence des ionophores à la surface des flacons.
  2. Tampons
    1. Préparez de nouveaux tampons le jour de l’expérience (tableau 1). Ne pas conserver plus de 24 h.
  3. Purification des protéines solubles
    1. Express ArcA, ArcB, ArcC (nous utilisons une variante spécifique nommée ArcC1), PercevalHR et GlpK comme décrit précédemment 27,28,33. Assurez-vous d’ajouter 10 % v/v de glycérol au tampon de lyse cellulaire, ce qui améliore la stabilité des protéines. Purifier les protéines solubles comme décrit27, 28, 33 et brièvement rapporté ci-après.
    2. Décongeler 10 mL de lysat cellulaire (~5 g de poids humide) dans un bain d’eau glacée. Entre-temps, appliquer 2 mL (1 CV) de résine Ni2+-Sepharose sur une colonne d’écoulement par gravité (capacité de 20 mL) avec de l’eau désionisée (12 CV) et un tampon B (4 CV) pour laver. Transférer le lysat décongelé dans de la glace ; travail sur glace, sauf indication contraire.
    3. Ajouter de l’imidazole à une concentration finale de 10 mM au lysat décongelé, puis verser la solution sur la colonne d’écoulement par gravité. Incuber pendant 1 heure à 4 °C avec une nutation douce.
    4. Après 1 h, jetez le flux et lavez la résine avec le tampon C (20 CV).
    5. Éluer la protéine avec le tampon D. Utilisez 60 % de CV pour la première étape d’élution, suivie de 4 à 6 étapes de 40 % de CV.
    6. Déterminer la concentration en protéines et ajouter du Na-EDTA à une concentration finale de 5 mM.
    7. Faites tourner la protéine purifiée dans une centrifugeuse de table réfrigérée (vitesse maximale, 10 minutes, 4 °C). Purifier par chromatographie d’exclusion stérique à l’aide du tampon E. Regrouper les fractions d’élution et les concentrer à ~10 mg/mL avec un filtre concentrateur avec une coupure de 30 kDa. Préparez des aliquotes de taille appropriée (~ 20 μL), congelez-les avec de l’azote liquide et conservez-les à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
      REMARQUE : Il est important de concentrer les enzymes à 50-100 μM pour minimiser le volume nécessaire à l’encapsulation.
  4. Purification des protéines membranaires
    1. Surexpression de l’ArcD et du GlpT comme décrit précédemment 22,27,33. Assurez-vous d’ajouter 10 % v/v de glycérol au tampon de lyse cellulaire ; pour la purification de l’ArcD, inclure 2 mM d’agent réducteur (p. ex., DTT) dans la mémoire tampon. Purifier les protéines marquées par affinité par chromatographie Ni2+-sépharose.
      1. Décongeler une aliquote de vésicules membranaires brutes (10 à 20 mg de protéines membranaires totales) dans un bain d’eau glacée.
        REMARQUE : Une fois décongelé, travaillez toujours sur de la glace, sauf indication contraire. Voir le Tableau 1 pour connaître les tampons utilisés dans cette section.
      2. Ajouter les vésicules membranaires dans le tampon F (ArcD) ou le tampon G (GlpT) jusqu’à un volume final de 6 ml. Incuber l’échantillon pendant 1 h à 4 °C avec une nutation douce.
      3. Séparer les protéines membranaires solubilisées des débris membranaires par ultracentrifugation (337 000 × g, 30 min, 4 °C). Entre-temps, appliquer 0,25 mL (1 CV) de résine Ni2+-sépharose sur une colonne d’écoulement par gravité (capacité de 10 mL) avec de l’eau désionisée (40 CV) et 20 CV de tampon H (ArcD) ou de tampon I (GlpT).
      4. Verser la protéine solubilisée sur la colonne d’écoulement par gravité et ajouter de l’imidazole à une concentration finale de 10 mM. Incuber pendant 1 h à 4 °C avec une nutation douce.
      5. Après 1 h, jetez le flux continu et lavez la résine avec 20 CV de tampon J (ArcD) ou de tampon K (GlpT).
      6. Éluer la protéine membranaire par paliers de 60 % de CV (1ère) et de 40 % de CV (2e-6 e) avec le tampon L (ArcD) ou le tampon M (GlpT).
      7. Déterminer la concentration en protéines et passer à la section 2.2. pour la reconstitution membranaire.
        REMARQUE : La purification par exclusion stérique n’est pas nécessairement effectuée pour les protéines membranaires car la reconstitution membranaire produit une purification similaire. Les étapes 1.4 et 2.2 peuvent être effectuées en 1 jour de travail. Commencez par la purification des protéines (étape 1.4) le matin et poursuivez avec la reconstitution (étape 2.2) l’après-midi. La reconstitution se termine le lendemain (voir section 2.2 pour plus de détails). POINT D’ARRÊT : Les ArcD et GlpT purifiés et solublés au DDM peuvent être stockés à -80 °C pour une utilisation ultérieure, mais ce n’est pas le cas pour toutes les protéines membranaires. Préparez des aliquotes de taille appropriée (50-200 μL), congelez-les avec de l’azote liquide et conservez-les à -80 °C pour une utilisation ultérieure. Ces protéines sont actives pendant plusieurs mois lorsqu’elles sont stockées à -80 °C en présence de glycérol à 10% v/v.
  5. Préparation de β-caséine à des fins de passivation
    1. Mettre de nouveau en suspension 100 mg de β-caséine dans 20 mL d’eau désionisée et titrer avec 1 M de NaOH jusqu’à ce que la β-caséine soit complètement dissoute. Ensuite, ajoutez 1 M d’acide acétique pour ajuster le pH à 7,0 et remplissez le volume à 50 ml avec de l’eau désionisée. Filtrer la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm et faire des aliquotes de 500 μL.
      REMARQUE : La β-caséine peut être conservée à -20 °C pendant 6 mois. Il est recommandé de filtrer à nouveau la β-caséine avant utilisation pour éviter que les agrégats de β-caséine n’obstruent la puce microfluidique.

Tampon Composition
Tampon A 50 mM KPi pH 7,0
Tampon B 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10 % v/v de glycérol, 10 mM d’imidazole, pH 7,5
Tampon C 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10 % v/v de glycérol, 50 mM d’imidazole, pH 7,5
Tampon D 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10 % v/v de glycérol, 500 mM d’imidazole, pH 7,5
Tampon E 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10 % v/v de glycérol, pH 7,0
Tampon F 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,5 % p/v DDM, 10 % v/v glycérol, 2 mM β-mercaptoéthanol, pH 7,5
Tampon G 50 mM de Tris-HCl, 0,5 % p/v DDM, 20 % v/v de glycérol, pH 8
Tampon H 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,02 % p/v DDM, 10 % v/v glycérol, 2 mM β-mercaptoéthanol, 10 mM imidazole, pH 7,5
Tampon I 50 mM de Tris-HCl, 0,04 % p/v de DDM, 20 % v/v de glycérol, 10 mM d’imidazole, pH 8,0
Tampon J 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02 % p/v DDM, 10 % v/v glycérol, 2 mM β-mercaptoéthanol, 50 mM d’imidazole, pH 7,5
Tampon K 50 mM de Tris-HCl, 0,04 % p/v de DDM, 20 % v/v de glycérol, 50 mM d’imidazole, pH 8
Tampon L 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02 % p/v DDM, 10 % v/v glycérol, 2 mM β-mercaptoéthanol, 500 mM imidazole, pH 7,5
Tampon M 50 mM de Tris-HCl, 0,04 % p/v de DDM, 20 % v/v de glycérol, 500 mM d’imidazole, pH 8
Zone tampon N 50 mM KPi, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0
Tampon O 50 mM de KPi, 0,5 mM de L-ornithine, 10 mM de Na-ADP, 10 mM de MgCl2, 2 mM de DTT, pH 7,0
Tampon P 50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, x mM glucose (x est varié pour correspondre à l’osmolarité du milieu externe et interne)
Tampon Q 50 mM KPi pH 7,0, 0,5 mM Saccharose, 2 mM DTT
Tampon R 50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, 10 mM L-arginine, x mM glucose

Tableau 1 : Tampons utilisés dans ce protocole.

2. Protéoliposomes : reconstitution de protéines membranaires purifiées en vésicules lipidiques préformées

  1. Jour 1
    1. Préparation de vésicules lipidiques préformées
      1. Choisissez la composition lipidique (par exemple, phospholipides synthétiques, lipides polaires d’E. coli ) en fonction des besoins des protéines membranaires.
        REMARQUE : Un mélange de DOPE, DOPG et DOPC (25:25:50 % molaire) est un bon point de départ, mais des stérols ou de la cardiolipine peuvent être nécessaires pour certaines protéines ; Pour les protéines de membrane plasmique de levure, nous incluons des lipides de palmitoyl-oléoyle au lieu de dioleoyl30. Un mélange de DOPE, de DOPG et de DOPC (25:25:50 % molaire) suffit pour la reconstitution d’ArcD et de GlpT.
      2. Mélangez les lipides souhaités (solubilisés dans le CHCl3) et évaporez le CHCl3 dans un évaporateur rotatif jusqu’à formation d’un film lipidique. Laver les lipides en ajoutant de l’éther diéthylique à volume égal à celui du CHCl3. Évaporer l’éther diéthylique et obtenir un film lipidique sec.
      3. Remettre en suspension le film lipidique à 20 mg/mL de lipides totaux en milieu aqueux (tampon A). Commencez avec la moitié du volume total et secouez doucement ; Ensuite, transférez soigneusement les lipides dans un tube ou une bouteille propre de taille adéquate. Ajoutez le tampon A frais dans le flacon et répétez la procédure pour dissoudre les lipides restants et les transférer dans un nouveau récipient. Ajouter du tampon A supplémentaire pour atteindre une concentration finale de 20 mg/mL.
      4. Sonicer les lipides remis en suspension à l’aide d’une sonde sonicatrice. Utilisez les paramètres suivants pour une pointe de sonicateur d’un diamètre de 6 mm : intensité de 4 μm, amplitude de 70 %, 5 s de marche, 45 s de désactivation, 16 cycles. Plongez les lipides dans un bain d’eau glacée contenant de l’EtOH pour éviter la surchauffe par sonication.
      5. Congelez l’échantillon soniqué (volume de 40 mL dans un tube à centrifuger de 50 mL) dans de l’azote liquide et décongelez l’échantillon dans un bain-marie à température ambiante. Répétez une fois ; ensuite, aliquote les liposomes dans les volumes souhaités (par exemple, 1 mL ou 20 mg de lipides totaux dans un tube en plastique de 1,5 mL).
        POINT D’ARRÊT : La procédure peut être arrêtée à ce stade. Congelez à nouveau chaque aliquote (troisième cycle) et stockez-la dans de l’azote liquide jusqu’à quelques mois. Prenez soin de percer les couvercles du tube deux fois avec une aiguille pour éviter l’explosion du tube lors de l’ébullition rapide de l’azote liquide.
  2. Jour 2
    1. Reconstitution de protéines membranaires purifiées en liposomes préformés
      1. Décongeler une aliquote de liposomes (20 mg de lipides totaux) dans un bain-marie à température ambiante. Pendant ce temps, préparez une extrudeuse en appliquant un filtre de votre choix (par exemple, polycarbonate, diamètre des pores de 400 nm) ; pré-équilibrer l’extrudeuse avec le tampon A ; et chargez les liposomes décongelés (« solution laiteuse ») dans l’extrudeuse et passez-les 13 fois à travers le filtre. Recueillir les liposomes extrudés (maintenant de grandes vésicules unilamellaires ; « solution opaque ») dans un récipient en verre ou en plastique de taille adéquate (p. ex., 15 ml). Diluer les liposomes à 4 mg/mL avec le tampon A complété par 2 mM de DTT.
      2. Transvaser 1 mL de liposomes à 4 mg/mL dans une cuvette transparente de 1 mL. Dans un spectrophotomètre, mesurez la densité optique initiale à 540 nm. Versez l’échantillon mesuré et ajoutez 50 μL de Triton X-100 à 10 % v/v dans les liposomes.
        REMARQUE : Un volume de titrage de 50 μL de 10 % de Triton-X100 convient à 20 mg de lipides dans un volume de 5 mL ; l’ajout de Triton X-100 va diluer les lipides de ~5%. Ajustez le volume de titrage lorsque vous travaillez avec différentes quantités de liposomes. Pour des signaux de densité optique stables, titrez les liposomes avec Triton X-100 à température ambiante.
      3. Répétez l’étape 2.2.1.2 et notez quand une densité optique maximale est atteinte (Rsat). Poursuivez le titrage jusqu’à ce qu’une densité optique d’environ 60 % de Rsat soit atteinte (Figure 4). Versez les vésicules déstabilisées par le détergent dans le tube en verre/plastique (le volume final est maintenant d’environ 5,2 ml), transférez l’échantillon dans de la glace et laissez-le refroidir.
      4. Ajoutez la ou les protéines membranaires purifiées aux liposomes déstabilisés pour atteindre un rapport lipide/protéine souhaité (p/p). Utilisez un rapport de 400:1 à 100:1 p/p ; puisque ArcD et GlpT ont tous deux des poids moléculaires de ~55 kDa, un rapport lipides/protéines de 400:1 p/p correspond à ~30 000 lipides par protéine, et ~ 50 molécules d’ArcD et de GlpT chacune par vésicule d’un diamètre de 400 nm.
        REMARQUE : Ici, nous utilisons 400:1 p/p, ce qui correspond à 50 μg de chaque protéine pour 20 mg de lipides.
      5. Nuter les échantillons à 4 °C pendant 15 min pour permettre aux protéines membranaires de s’insérer dans la membrane liposomale déstabilisée.
      6. Pour enlever le détergent, ajoutez 200 mg de billes de polystyrène sèches, préparées selon les instructions du fabricant. Nuter à 4 °C pendant 15 minutes supplémentaires.
        REMARQUE : Une quantité de 200 mg de billes sèches convient pour 20 mg de lipides, mais doit être ajustée lorsqu’une taille d’échantillon différente est utilisée.
      7. Répétez l’étape 2.2.1.6 2 fois, pour un total de trois ajouts de billes de polystyrène. Ensuite, incuber toute la nuit à 4 °C avec une légère nutation.
  3. Jour 3
    1. Répétez l’étape 2.2.1.6 ; cependant, cette fois-ci, nuter à 4 °C pendant 1 h.
    2. Fixez une colonne d’écoulement par gravité vide (capacité de 10 ml) au-dessus d’un tube d’ultracentrifugation vide de 6,5 ml sur de la glace. Versez l’échantillon dans la colonne et récupérez les protéoliposomes dans le tube d’ultracentrifugation (les billes sont retenues dans la colonne).
    3. Laver les billes avec 0,5 mL de tampon A complété par 2 mM de DTT et recueillir le filtrat dans le tube d’ultracentrifugation.
    4. Concentrer les protéoliposomes par ultracentrifugation (337 000 × g, 30 min, 4 °C). Remettre en suspension les protéoliposomes dans un volume total de 200 μL (100 mg de lipides/mL) dans le tampon A complété par 2 mM de DTT ; le volume sec des vésicules après centrifugation est de ~40 à 120 μL27. Diviser en aliquotes de la taille désirée (p. ex., trois aliquotes de 6,66 mg de lipides totaux).
      REMARQUE : La taille de l’aliquote est arbitraire mais affectera la taille des granulés dans les étapes ultérieures (voir étape 3.2.3.1). POINT D’ARRÊT : La procédure peut être arrêtée ici. Congelez chaque aliquote et conservez-la dans de l’azote liquide jusqu’à quelques semaines. Prenez soin de percer les couvercles du tube deux fois avec une aiguille pour éviter l’explosion du tube lors de l’ébullition rapide de l’azote liquide.

Figure 4
Figure 4 : Titrage de liposomes préformés avec Triton X-100. Les liposomes à 5 mg de lipides/mL sont extrudés à travers un filtre en polycarbonate (400 nm) dans 50 mM KPi (pH 7,0), puis titrés avec Triton X-100 (étape du protocole 2.2.1.2). La turbidité des vésicules est mesurée à A540. La flèche indique la concentration de Triton X-100 à laquelle les vésicules sont suffisamment déstabilisées pour l’insertion spontanée de protéines membranaires comme décrit en19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Encapsulation d’un réseau métabolique pour le recyclage de l’ATP et la synthèse du glycérol 3-P dans des vésicules de taille submicronique

  1. Jour 1
    1. Mélange de composants
      1. Pour une encapsulation standard, utilisez 66,6 μL de protéoliposomes dans un volume final de 200 μL (33,33 mg/mL de lipides totaux). Calculez le volume de chaque composant (enzyme, cofacteur) nécessaire pour atteindre la concentration souhaitée, ajoutez ces composants aux protéoliposomes et ajustez le volume à 200 μL avec le tampon A (tableau 2).
        REMARQUE : La concentration en protéines peut être ajustée en fonction de la configuration expérimentale. Cependant, il faut veiller à ce que plusieurs copies (>10) de chaque enzyme soient en moyenne présentes par vésicule, afin d’éviter des effets stochastiques indésirables. Les concentrations > 1 μM sont généralement sans danger ; 1 μM dans une vésicule d’un diamètre de 400 nm correspond à environ 20 copies (Figure 3).
      2. Pipeter le tampon A dans un tube vide de 1,5 mL et ajouter le DTT, le Na-ADP, le MgCl2, la L-ornithine (et la pyranine, si nécessaire pour les mesures de pH internes). Ensuite, ajoutez les enzymes et mélangez doucement. Ajoutez la solution sur les protéoliposomes préformés et agitez brièvement à basse vitesse.
        REMARQUE : Il est important d’ajouter du Na-ADP avant le MgCl2 pour éviter la formation indésirable de précipités de phosphate de magnésium. Le vortex est nécessaire pour un bon mélange de la solution visqueuse ; Cependant, minimisez la durée et la vitesse pour éviter d’endommager mécaniquement les protéines. PercevalHR et la pyranine ne peuvent pas être co-encapsulés car leurs spectres se chevauchent.
    2. Détermination de l’osmolalité interne
      1. Préparez une solution de 50 μL comme décrit à l’étape 3.1.1.1, mais sans protéoliposomes, et mesurez l’osmolalité à l’aide d’un osmomètre à point de congélation.
      2. Préparez une courbe d’étalonnage à l’aide d’un tampon (50 mM KPi pH 7,0) et de différentes concentrations de sel (p. ex., NaCl ou NaCl) ou de sucre. Déterminez la concentration d’osmolyte qui correspond à l’osmolalité interne (tampon N).
        REMARQUE : Les composants perméables à la membrane (par exemple, le glycérol) ne peuvent pas être utilisés pour correspondre à l’osmolalité interne. Pour les protéines solubilisées dans un tampon contenant du glycérol (par exemple, le tampon E), le même tampon doit être utilisé sans glycérol. L’osmolyte choisi pour la préparation d’un tampon externe iso-osmotique doit être imperméable à la membrane et ne pas interférer avec le réseau métabolique.
    3. Gel-dégel
      1. Congeler (dans de l’azote liquide) les protéoliposomes avec les composants solubles et les décongeler dans un bain d’eau glacée à environ 10 °C.
      2. Répétez l’étape 3.1.3.1 pour un total de 5 fois.
        POINT D’ARRÊT : La procédure peut être arrêtée ici. Sautez la dernière étape de décongélation et conservez l’échantillon congelé dans de l’azote liquide pendant 1 à 3 jours. Prenez soin de percer les couvercles du tube 2x avec une aiguille pour éviter l’explosion du tube lors de l’ébullition rapide de l’azote liquide. Le stockage dans l’azote liquide est préférable à -80 °C pour minimiser l’oxydation des lipides.
  2. Jour 2
    1. Extrusion
      REMARQUE : Toutes les étapes d’extrusion sont effectuées à température ambiante, sinon les seringues étanches au gaz fuiraient.
      1. Préparez une extrudeuse en appliquant le filtre de votre choix (par exemple, polycarbonate, diamètre des pores de 400 nm). Laver l’extrudeuse avec une solution contenant le même tampon et les mêmes métabolites que ceux utilisés pour l’encapsulation des vésicules (par exemple, le tampon O plus 0,1 mM de pyranine).
        REMARQUE : Utilisez une extrudeuse dédiée pour le chargement des protéoliposomes avec de la pyranine car le colorant adhère à la surface de l’extrudeuse et peut provoquer une contamination dans les échantillons ultérieurs.
      2. Chargez le mélange d’encapsulation dans l’extrudeuse et passez-le à travers le filtre 13x. Recueillir la solution extrudée dans un tube de 1,5 mL.
    2. Chromatographie d’exclusion stérique (en option)
      REMARQUE : Cette étape est effectuée pour éliminer les molécules externes telles que les colorants comme la pyranine par chromatographie d’exclusion stérique. Si les colorants ne sont pas présents dans le système et que d’autres composants n’interfèrent pas à de faibles concentrations (notez que les vésicules sont ensuite également lavées par ultracentrifugation), alors étape 3.2.2. peut être ignoré.
      1. Réhydratez la résine Sephadex G-75 et versez-la dans une colonne de verre (22 cm de long, 1,5 cm de large). Équilibrez la résine avec un excès de tampon externe (par exemple, tampon N).
      2. Chargez les protéoliposomes extrudés de l’étape 3.2.1.2 sur la colonne de chromatographie d’exclusion stérique prééquilibrée et appliquez un écoulement gravitaire de tampon externe. Jeter le volume du vide (environ 7 ml) ; puis, prélever dix aliquotes de 1 mL. Visualisez les aliquotes contenant des protéoliposomes par une courte exposition à une lampe UV. Mettez en commun les fractions contenant la plupart des protéoliposomes (2-4 mL).
    3. Lavage et remise en suspension
      1. Laver les protéoliposomes extrudés par ultracentrifugation. Remplissez un tube d’ultracentrifugation de 6,5 ml avec 5,8 ml de tampon N et appliquez l’échantillon extrudé sur le dessus. Si une chromatographie d’exclusion stérique a été effectuée, remplissez le tube avec les échantillons d’élution regroupés (2 à 4 ml) et ajoutez le tampon N à un volume final de 6 ml.
      2. Centrifugeuse à 337 000 × g, 30 min, 4 °C. Jetez le surnageant et séchez soigneusement le tube d’ultracentrifugation avec un chiffon sans poussière tout en faisant attention à ne pas toucher la pastille. Remettre la pastille en suspension dans un petit volume de tampon N (200 μL). Lorsque la pastille est complètement remise en suspension, remplissez le tube jusqu’à 6 ml avec le tampon N.
        REMARQUE : la remise en suspension du granulé prendra du temps et doit être effectuée avec soin.
      3. Répéter les étapes 3.2.3.1 à 3.2.3.2 2 fois, pour un total de trois lavages, à moins qu’une chromatographie d’exclusion stérique ne soit effectuée (auquel cas une seule étape de centrifugation suffit). En fin de compte, remettre la pastille en suspension à la concentration désirée (p. ex., 5,55 mg/mL de lipides totaux) en ajoutant un volume approprié de tampon N.
        POINT D’ARRÊT : Les protéoliposomes peuvent être utilisés immédiatement ou stockés à 4 oC pendant au moins 48 h. La taille des tubes d’ultracentrifugation doit être choisie en fonction de la taille de l’échantillon. Pour une pastille de 6,66 mg de lipides totaux, un tube de 6,5 mL est approprié. Le lavage de 200 μL de protéoliposomes (33,33 mg de lipides/mL au total ; volume de granulés secs ~40 μL)28 pour 3 x 6 mL de tampon dilue les composants externes d’un facteur 100 pour chaque étape de lavage. Si des tubes de différentes tailles sont utilisés, il est souhaitable d’ajuster le nombre de lavages en conséquence.
  3. Jour 3
    1. Détection de la synthèse d’ATP par fluorescence
      1. Mélanger les composants de la réaction jusqu’à un volume final de 120 μL (tableau 3) dans une cuvette en quartz noir avec une fenêtre de 3 x 5 mm et un volume interne minimal de 100 μL.
        REMARQUE : Des ionophores peuvent être ajoutés pour dissiper les gradients d’ions électrochimiques. Un mélange de valinomycine et de nigéricine (1 μM chacun) dissipe efficacement tous les gradients de protons et de potassium.
      2. Préchauffez l’échantillon dans un fluorimètre réglé à 30 °C et acquérez les spectres d’excitation de PercevalHR (excitation 400-520 nm, bande passante 5 nm ; émission 550 nm, bande passante 5 nm). Une fois que le signal de la sonde est constant, démarrer le réseau métabolique par l’ajout d’un excès de L-arginine (5-10 mM), et de glycérol (400 μM) lorsque le recyclage de l’ATP est couplé à la synthèse du glycérol 3-phosphate. Suivez la réaction au fil du temps.
    2. Analyse des données
      1. Tracez le rapport F500/F430 en fonction du temps, qui est un indicateur qualitatif du rapport ATP/ADP. Pour une évaluation plus quantitative de la formation de l’ATP, construisez une courbe d’étalonnage dans les protéoliposomes ou utilisez une approche complémentaire (par exemple, la quantification de l’ATP par chimiluminescence28).
Composant Concentration finale
Tampon A 50 mM KPi pH 7,0
La TNT 2 millions d’euros
Na-ADP 10 millions de kilomètres
MgCl2 10 millions de kilomètres
L-ornithine 0,5 million d’euros
Sonde fluorescente (PercevalHR ou pyranine) 5,8 μM ou 0,1 mM, respectivement
ArcA (arginine déiminase) 1 μM
ArcB (ornithine carbamoyltransférase) 2 μM
ArcC1 (carbamamate kinase) 5 μM
GlpK (glycérol kinase) 1,6 μM
Protéoliposomes 33,33 mg/mL de lipides totaux

Tableau 2 : Composants d’encapsulation. Les composants sont répertoriés par ordre d’ajout. Les protéines solubles se trouvent dans le tampon E ; tous les autres composants (à l’exception du MgCl2, dans l’eau désionisée) se trouvent dans la zone tampon A.

Composant Concentration finale
Tampon K 50 mM KPi pH 7,0, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0
Protéoliposomes (5,55 mg/mL de lipides) 2,7 mg/mL de lipides
Ionophores (valinomycine, nigéricine) 1 μM chacun

Tableau 3 : Conditions expérimentales. Les composants sont répertoriés par ordre d’ajout. Les protéoliposomes sont dans le tampon N, les ionophores dans le DMSO ou l’EtOH.

4. Mise à l’échelle d’un réseau métabolique pour des vésicules de taille micrométrique

  1. Jour 1
    1. Préparation de la puce microfluidique
      REMARQUE : Cette expérience utilise un dispositif microfluidique mis au point par Robinson et al.34. D’autres conceptions de puces microfluidiques sont disponibles 35,36,37 et peuvent facilement être mises en œuvre dans ce protocole.
      1. Coupez une pointe de pipette de 200 μL à un tiers du bas et insérez la partie inférieure de la pointe dans un dispositif de piégeage microfluidique préfabriqué.
      2. Dans le réservoir d’entrée de la puce, ajoutez 400 μL de solution de β-caséine (2 mg/mL ; voir étape 1.5), en prenant soin d’éviter l’introduction d’air à cette étape. Placez un seau à plaques de 96 puits et ajoutez un mouchoir de laboratoire dans une centrifugeuse à tube conique de table. Placez la puce sur le tissu et centrifugez pendant 6 minutes à 900 × g pour permettre la passivation de la puce microfluidique. Après l’étape de centrifugation, le niveau de liquide doit être égal sur le réservoir d’entrée et l’extrémité de sortie de la puce microfluidique ; Vérifiez qu’il n’y a pas de fuite de la puce. Incuber la solution de β-caséine dans la puce microfluidique pendant au moins 30 min.
      3. Retirez la majeure partie de la solution de passivation sans introduire d’air et ajoutez 400 μl de tampon de lavage (tampon P). Placez la puce sur le godet à plaques à 96 puits et centrifugez à 900 × g pendant 6 min. Laissez la puce dans la solution de lavage jusqu’à l’utilisation (pendant 4h maximum).
  2. Préparation de gel pour la fabrication de protéo-GUVs
    NOTE : La description suivante est tirée et adaptée de 25,38.
    1. Dissoudre 0,5 % (p/p) d’une agarose à basse température gélifiante (LGT) dans de l’eau désionisée en chauffant la solution au micro-ondes ; Assurez-vous que l’agarose est complètement dissoute et évitez de faire bouillir la solution. Maintenez l’agarose à 50 °C jusqu’à nouvel ordre.
      REMARQUE : L’agarose dissoute peut être conservée à température ambiante pendant plusieurs semaines. Pour réutiliser l’agarose, il suffit de faire fondre le gel à l’aide d’un micro-ondes.
    2. Prenez deux diapositives d’objectif et dessinez le contour de l’entretoise sur les diapositives. Rendez les lames hydrophiles par nettoyage au plasma, en utilisant du plasma à haute teneur en oxygène pendant 1 min.
    3. Ajouter de l’agarose LGT sur le dessus de la lame jusqu’à ce qu’elle soit entièrement recouverte d’agarose (~500 μL) ; Ensuite, inclinez la glissière à un angle de 90 ° et égouttez l’excès d’agarose sur un mouchoir. Laissez les lames pendant 30 min à 50 °C.
    4. Prendre les protéoliposomes stockés dans de l’azote liquide (section 3) et les décongeler sur de la glace. Diluer les vésicules à 5 mg/mL de lipides à l’aide du tampon Q.
      REMARQUE : Les protéoliposomes préparés dans la section 3 ne contiennent pas de protéines solubles et peuvent être préparés bien à l’avance s’ils sont stockés dans de l’azote liquide. Lorsque vous travaillez avec des proteoGUVs, assurez-vous de toujours filtrer les solutions de travail pour éviter le colmatage du dispositif microfluidique.
    5. Sonicer les protéo-liposomes à l’aide d’une sonde portative avec une sonde de 1 mm. Sonicate pendant 10 cycles de 0,5 s et 0,5 s de repos à 70 % d’amplitude. Maintenez les vésicules, ci-après appelées protéoSUVs, sur la glace pendant 30 s et répétez le processus de sonication 5 fois.
    6. Remplissez une seringue de 100 μL (dans un distributeur LCP portable) avec la suspension proteo-SUV. Déposer 0,5 μL de gouttelettes de protéo-SUV sur le gel d’agarose préalablement préparé ; Veillez à ne pas perturber la couche d’agarose et à garder une distance suffisante pour éviter que les gouttelettes ne fusionnent.
      REMARQUE L’utilisation d’un distributeur LCP portatif permet de déposer des gouttelettes de manière reproductible, mais d’autres systèmes de pipetage peuvent également être utilisés. Le spotting avec un capillaire de verre est moins adapté car il perturbe le gel d’agarose séché.
    7. Séchez les gouttelettes SUV en ~10 min en utilisant un flux d’azote au lieu d’air comprimé pour réduire la possibilité d’oxydation des lipides.
    8. Préparez 1 mL d’un tampon O concentré 1,25x (tableau 4) dans le tampon A et passez-le à travers un filtre en acétate de cellulose de 0,2 μm. Prélever 800 μL de la solution concentrée 1,25x et ajouter les enzymes solubles et les sondes à la concentration indiquée dans le tableau 4. Utilisez de l’eau désionisée filtrée pour obtenir un volume final de 1 ml.
    9. Préparez 100 μL de solution gonflante contenant tous les composants du tableau 4, à l’exception des protéines et du glycérol. Mesurez l’osmolalité de la solution gonflante à l’aide d’un osmomètre à point de congélation calibré en 3 points.
      REMARQUE : Préparez 100 μL de solution gonflante sans protéines ni glycérol pour déterminer avec précision l’osmolalité de cette solution. Le glycérol, qui est présent dans la solution protéique, affecte l’osmolalité, mais, dans les GUV, le glycérol se diffuse rapidement à travers la membrane et n’entraîne que des différences osmotiques transitoires.
    10. Assemblez la chambre de gonflage GUV en fabriquant un sandwich de deux verres d’objectif contenant le gel et des SUV séchés avec une entretoise en téflon de 1,5 ou 3,0 mm d’épaisseur entre les deux. Ensuite, ajoutez la solution de gonflement dans la chambre à travers le petit trou sur le côté à l’aide d’une seringue et d’une aiguille.
      REMARQUE : Le volume de la solution de gonflement peut être ajusté en faisant varier les entretoises de 1,5 à 3,0 mm.
  3. Gonflement des vésicules et prélèvement des GUV
    1. Permettre le gonflement des vésicules en mettant la chambre à 22 °C pendant au moins 30 min.
      REMARQUE : Le gonflement des vésicules peut être suivi d’une microscopie optique (par exemple, un microscope à contraste de phase de table ou un microscope à fluorescence à grand champ) si les protéines ou les lipides sont marqués par fluorescence.
    2. Récoltez les GUV du gel en appliquant une légère agitation physique en tapotant la chambre sur une surface solide (p. ex., une paillasse de laboratoire) ; retirez un tiers du volume et utilisez la bulle d’air résultante pour induire doucement un mouvement vers le liquide restant, détachant ainsi les GUV du gel.
    3. Pendant que les GUV gonflent, préparez le tampon P et faites correspondre l’osmolalité avec la solution gonflante en ajustant la concentration de glucose. Filtrez le tampon à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm.
      REMARQUE : En général, la solution de lavage et de substrat doit être maintenue dans ± 5 mosmol/kg. Toute solution passant à travers la puce doit être très propre car les contaminants peuvent obstruer les canaux. Préparez de nouveaux tampons à chaque fois ou stockez les tampons préparés à -20 °C et filtrez avant utilisation.
  4. Piégeage des GUV pour des expériences de microscopie
    1. Montez la puce microfluidique passivée sur la platine d’échantillonnage du microscope. Vérifiez s’il y a d’éventuels défauts (p. ex., fuites, air emprisonné, canaux obstrués).
      REMARQUE : La vérification de la puce peut être effectuée bien avant de l’utiliser afin qu’une nouvelle puce puisse être préparée si nécessaire.
    2. Raccordez le tube à l’aide d’une aiguille pliée à la sortie du réservoir et connectez l’autre extrémité à une seringue de 1 ml. Montez la seringue sur une pompe et réglez le débit à un maximum de 10 μL/min.
    3. Retirez le tampon de lavage du réservoir (étape 4.1.1.3) et remplacez-le par un fluide frais (tampon P). Démarrer l’écoulement du tampon à travers la puce en perfusant à l’aide de la seringue à 1-10 μL/min. Laver avec au moins 80 μL de tampon de lavage osmotiquement équilibré (tampon P).
    4. Retirez l’excès de tampon de lavage du réservoir et ajoutez les (proteo)GUVs dans le réservoir. Ajustez le débit à 0,1 à 1 μL/min pour permettre aux GUV de circuler à travers la puce. Surveillez la puce au fil du temps jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de GUV aient été piégés dans la puce.
      REMARQUE : Les vésicules contenant des quantités relativement importantes (>20 % molaire) de lipides chargés tels que le phosphatidylglycérol (PG), le phosphatidylsérine (PS) ou l’acide phosphatidique (PA) ou des lipides non bicouches comme la phosphatidyléthanolamine (PE) sont introduites à un débit plus faible à travers la puce pour éviter l’éclatement. Les vésicules composées de phosphatidylcholine pure (PC) ont tendance à être plus stables.
    5. Éliminer l’excès de solution GUV et ajouter le tampon de lavage P, en utilisant un débit constant de 0,1 à 1 μL/min, pour remplacer le milieu externe et laver les GUV piégés pendant au moins 1 h pour éliminer les composés non encapsulés et réduire la fluorescence de fond lorsqu’un fluorophore est encapsulé. Surveiller la fluorescence de fond au fil du temps ; Si la fluorescence de fond ne diminue pas, la puce peut être bloquée.
    6. Localisez les pièges avec des quantités suffisantes de vésicules et enregistrez leurs positions. Appliquez les paramètres du microscope (par exemple, intensité laser, gain, longueur d’onde) et démarrez une expérience de série chronologique.
    7. Ajouter une solution de substrat osmotiquement équilibrée (tampon R) dans le réservoir et démarrer un débit de 0,5 μL/min.

Composants du tampon L
Composant 1,25 fois la concentration Concentration au travail
Tampon A 62,5 mM KPi pH 7,0 50 mM KPi pH 7,0
Saccharose 125 millions d’euros 100 millions de mètres
La TNT 2,5 millions d’euros 2 millions d’euros
Na-ADP 12,5 millions d’euros 10 millions de kilomètres
MgCl2 12,5 millions d’euros 10 millions de kilomètres
L-ornithine 0,625 million de kilomètres 0,5 million d’euros
Composants d’encapsulation
Pyranine ou PercevalHR 1 mM ou 20 μM
ArcA (arginine déiminase) 1 μM
ArcB (ornithine carbamoyltransférase) 2 μM
ArcC1 (carbamamate kinase) 5 μM

Tableau 4 : Composants de tampon O et d’encapsulation. Les composants sont répertoriés par ordre d’ajout. Tous les composants (à l’exception du MgCl2, dans l’eau désionisée) se trouvent dans le tampon A. Les composants d’encapsulation sont énumérés par ordre d’addition. Toutes les protéines hydrosolubles se trouvent dans le tampon E.

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Representative Results

La reconstitution des protéines membranaires solubilisées dans les liposomes nécessite la déstabilisation des vésicules préformées. L’ajout de faibles quantités de Triton X-100 entraîne initialement une augmentation de l’absorbance à 540 nm (A540) en raison d’une augmentation de la diffusion de la lumière par le gonflement des vésicules (Figure 4). La valeur maximale de A540 est le point où les liposomes sont saturés de détergent (Rsat), après quoi tout ajout supplémentaire de Triton X-100 entraînera une solubilisation partielle des vésicules. À Rsol, les liposomes sont complètement solubilisés (Figure 4). Pour la reconstitution des protéines membranaires, on utilise typiquement des vésicules déstabilisées à 60% au-delà de Rsat (indiqué par une flèche).

La protéine membranaire reconstituée ArcD est utilisée pour transporter la L-arginine dans les vésicules et la L-ornithine hors des vésicules et est utilisée avec les enzymes encapsulées ArcA, ArcB et ArcC pour recycler l’ATP de l’ADP et du phosphate inorganique. Le GlpT est un antiporteur du glycérol 3-phosphate/phosphate qui, avec le GlpK, est nécessaire à la synthèse (et à l’excrétion) du glycérol 3-phosphate à partir du glycérol et de l’ATP produit par la dégradation de la L-arginine. L’ajout de 5 mM de L-arginine à t = 0 aux protéoliposomes entraîne une forte augmentation du rapport de fluorescence PercevalHR à 500 et 430 nm d’excitation39, ce qui reflète le rapport ATP/ADP à l’intérieur des vésicules (Figure 5). Lors de l’ajout de glycérol, l’ATP est utilisé pour la synthèse du glycérol 3-phosphate, ce qui entraîne une diminution du rapport ATP/ADP28. La dégradation de la L-arginine entraîne également des changements de pH, qui peuvent être quantifiés à l’aide de la pyranine ou de la pHluorin27.

Figure 5
Figure 5 : Recyclage de l’ATP par la voie de dégradation de la L-arginine. Les LUV à 2,7 mg de lipides/mL sont placés dans une cuvette et le rapport de fluorescence à 500 nm et 430 nm est enregistré. 5 mM de L-arginine sont ajoutés à t = 0. Le rapport F500/F430 est une mesure du rapport ATP/ADP à l’intérieur des vésicules. Abréviation : LUVs = grandes vésicules unilamellaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les LUV produisant de l’ATP peuvent également être utilisés pour former des GUV. La réhydratation de protéo-LUV séchés sur un gel d’agarose LGT entraîne la formation de vésicules de taille micrométrique (Figure 6). La formation de protéo-GUVs dans les taches de LUV séchées dépend fortement de la concentration locale en lipides et du degré de déshydratation. Certaines zones ont de grandes taches de GUV, tandis qu’à d’autres endroits dans la même gouttelette, il n’y a pas ou peu de GUV peuvent être formés. La formation de GUV par gonflement assisté par l’agarose LGT entraîne une gamme de tailles de GUV, généralement de quelques micromètres à plus de 50 μm.

Figure 6
Figure 6 : Images DIC des proteoGUVs formés par gonflement assisté par gel. Barre d’échelle = 25 μm. Abréviations : DIC = contraste interférentiel différentiel ; GUVs = vésicules géantes-unilammellaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les GUV sont récoltés et piégés dans un dispositif microfluidique à base de PDMS passivé à la caséine β (Figure 7). L’appareil est conçu de manière à ce que de nombreuses vésicules puissent être piégées et analysées au sein d’une seule expérience, et l’appareil est utilisé pour contrôler l’environnement externe (débit, composition du tampon, etc.) 34. Même lorsque le rendement des protéo-GUVs est faible, le flux constant de GUVs à travers la puce microfluidique permet de collecter de nombreuses vésicules. Une fois qu’un nombre suffisant de GUV sont piégés, le système est lavé avec un tampon osmotiquement équilibré pour éliminer les composants externes tels que les protéines solubles, les petites molécules et les sondes fluorescentes. Le tampon de lavage est ensuite remplacé par une solution de substrat d’osmolalité égale contenant 50 mM KPi (pH 7,0), des quantités variables de glucose (pour ajuster l’osmolalité) et des substrats tels que 10 mM de L-arginine. Une expérience de séries temporelles est réalisée sur plusieurs pièges de la puce microfluidique et des images sont prises toutes les 90 s (excitation 405 nm et 488 nm lorsque PercevalHR est utilisé). De plus, une image en fond clair est prise à chaque point temporel. Le rapport des intensités d’émission après excitation à 488 et 405 nm est une mesure du rapport ADP/ATP dans les vésicules.

Figure 7
Figure 7 : Piégeage des vésicules avec la puce microfluidique. (A) Piégeage des vésicules, accompagné de la capacité de contrôler l’environnement extérieur et le débit. (B) ProteoGUVs piégés dans un dispositif microfluidique et excités avec un laser de 405 nm (vert) et un laser 488 (rouge). L’émission des deux canaux est mesurée à >500 nm. L’image en fond clair permet de visualiser les vésicules sans fluorescence. Barre d’échelle = 25 μm. Abréviation : GUVs = vésicules géantes-unilamellaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous présentons un protocole pour la synthèse de protéines (membranaires) contenant des vésicules lipidiques de taille submicrométrique (proteoLUVs), et la conversion de proteoLUVs en vésicules géantes-unilamellaires (proteoGUVs). Le protocole devrait être applicable à la reconstitution d’autres protéines membranaires 13,19,30,40 et à l’encapsulation de réseaux métaboliques autres que les voies de dégradation de la L-arginine et de synthèse du glycérol 3-phosphate présentées ici.

La reconstitution des protéines membranaires dans les liposomes donne généralement une orientation aléatoire des protéines à l’intérieur de la membrane lipidique. Pour ArcD et Glpt, l’orientation n’a pas d’importance, car les protéines fonctionnent de manière bidirectionnelle et les solutés se déplacent en fonction du signe du potentiel électrochimique total. Pour les protéines qui fonctionnent dans une direction, la moitié des molécules ne seront pas disponibles pour l’activité lorsque leur orientation est de 50/50.

L’extrusion des vésicules à travers un filtre en polycarbonate rétrécit la distribution granulométrique, et les vésicules deviennent plus homogènes à mesure que la taille des pores des filtres est petite. Cependant, les vésicules plus petites se font au prix d’un volume plus petit et donc, d’un très petit nombre de protéines (enzymes, protéines membranaires) par vésicule. Pour minimiser la fraction de LUV ayant un ou plusieurs composants manquants, la concentration des protéines peut être ajustée comme le montre la figure 3A,B, mais avec de très petites vésicules, les effets stochastiques sont inévitables.

La méthode de gonflement assisté par gel repose sur le dépôt de vésicules soniquées (SUV) sur une surface d’agarose séchée. Au cours du processus de séchage, un gradient de concentration de vésicules se forme et la concentration en lipides est la plus élevée à la périphérie de la tache. Cela est dû à un phénomène connu sous le nom d’effet de tache de café41,42. En conséquence, seule une petite région de la tache contient une concentration de lipides adaptée à la formation de GUV. Les taches lipidiques circulaires inégales et concentrées entraînent de grandes zones inutilisées qui ne sont pas disponibles pour la fusion des vésicules ; par conséquent, l’efficacité de la formation de GUV devient faible dans cette approche. Pour augmenter le rendement des GUV, il faut viser un dépôt lipidique uniforme, ce qui peut être réalisé en appliquant un revêtement par centrifugation42 ou en tirant parti de l’effet de coloration au café41.

Autres notes sur le protocole :

Il faut veiller à ce que plusieurs protéines membranaires (>10) soient reconstituées en moyenne par vésicule pour éviter les effets stochastiques. Ainsi, évitez les rapports lipides/protéines supérieurs à 400:1 p/p. Une orientation aléatoire est supposée pour la plupart des protéines.

Idéalement, le volume des protéines membranaires totales est aussi petit que possible et ne dépasse de toute façon pas 10 à 20 % du volume des liposomes. L’ajout de plus grands volumes introduira plus de détergent et la majorité des liposomes préformés peuvent se lyser, ce qui peut avoir un effet négatif sur l’efficacité de la reconstitution.

Le pré-équilibrage de l’extrudeuse avec la solution appropriée est important pour éviter la dilution des composants lors de l’encapsulation. Idéalement, la solution de prééquilibrage devrait également contenir les enzymes solubles, mais l’inclusion d’enzymes peut être trop coûteuse en raison du volume relativement important nécessaire à la pré-équilibrage de l’extrudeuse. Par conséquent, nous omettons généralement ces composants et acceptons une dilution de 5% des enzymes.

Des ionophores doivent être ajoutés aux mélanges contenant des protéoliposomes car les molécules sont très hydrophobes et peuvent s’adsorber sur les surfaces si les vésicules ne sont pas présentes. Il faut veiller à ce que le volume de solvant ajouté soit faible (<1 % du volume total de la réaction). Des contrôles sont effectués pour vérifier que les solvants n’affectent pas les réseaux métaboliques dans les vésicules. Des concentrations d’ionophores d’environ 1 μM sont généralement sans danger pour des concentrations de lipides totaux de ~3 mg/mL.

Il faut prendre soin de bien sécher les gouttelettes. Si les gouttelettes ne sont pas assez sèches, la formation de GUV est moins efficace car les lipides formeront des agrégats de lipides et des MLV peuvent se former lorsque la solution gonflante est ajoutée.

Le glucose est utilisé pour faire correspondre l’osmolarité du milieu externe au milieu interne ; ce dernier contient du saccharose à la place du glucose pour augmenter la densité des vésicules et ainsi faciliter la sédimentation des GUVs. De plus, le glucose dans l’environnement extérieur améliore le contraste de phase, ce qui rend la vésicule plus facilement visible.

Les effets stochastiques sont beaucoup moins problématiques avec les GUV ; Mais ici, le rapport surface/volume peut devenir inacceptablement bas, de sorte que le nombre de protéines membranaires (par exemple, les transporteurs) devient limitant pour le réseau métabolique interne. La méthode décrite dans ce protocole ne permet pas un contrôle précis de la taille des proteoGUVs, mais la majorité se situe dans la gamme de taille de 5 à 50 μm.

En conclusion, les travaux présentés ici fournissent un aperçu complet de la reconstitution des protéines membranaires et de l’encapsulation enzymatique dans des vésicules lipidiques de tailles variables. Nous démontrons la construction de vésicules fonctionnelles pour la synthèse de l’ATP et des blocs de construction à partir de précurseurs simples tels que les acides aminés et le glycérol. La reconstitution des protéines membranaires dans les GUV reste un défi, mais les protocoles présentés ici ouvrent la voie à de nouveaux développements dans la recherche en biologie synthétique ascendante.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Aditya Iyer pour le clonage du gène pBAD-PercevalHR et Gea Schuurman-Wolters pour son aide à la production et à la purification des protéines. La recherche a été financée par le programme de gravitation du NWO « Building a Synthetic Cell » (BaSyC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Aldrich A9414-25g
Amicon cut-off filter Sigma Aldrich Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra 
BioBeads BioRad 152-3920
CHCl3 Macron Fine Chemicals MFCD00000826
D(+)-Glucose Formedium -
D(+)-Sucrose Formedium -
DDM Glycon D97002 -C
Diethyl Ether Biosolve 52805
DMSO Sigma-Aldrich 276855-100ml
DOPC Avanti 850375P-1g
DOPE Avanti 850725P-1g
DOPG Avanti 840475P-1g
DTT Formedium  DTT005
EtOH J.T.Baker Avantor MFCD00003568
Extruder Avestin Inc LF-1
Fluorimeter Jasco Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol BOOM 51171608
Gravity flow column Bio-Rad 732-1010
Hamilton syringe 100 µL Hamilton 7656-01
Hamilton syringe 1000 µL Hamilton 81320
Handheld LCP dispenser Art Robbins Instruments 620-411-00
Handheld Sonicator Hielscher Ultrasound Technology UP50H
HCl BOOM x76021889.1000
Imidazole Roth X998.4-250g
K2HPO4 Supelco 1.05099.1000
KCl BOOM 76028270.1
KH2PO4 Supelco 1.04873.1000
Kimwipe Kimtech Science 7552
Large Falcon tube centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006-100G
Light microscope Leica DM LS2
L-Ornithine Roth T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670-1KG
Microfluidic chip Homemade  PDMS based DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP Sigma-Aldrich A2754-1G
NaCl Supelco 1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer Isogen Life Science ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH Supelco 1.06498.1000
Needles for GUVs Henke-Ject 14-14575 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics Henke-Ject 14-15538 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose Cytiva 17526802
Nigericin Sigma-Aldrich N7143-5MG
Nutator VWR 83007-210
Osmolality meter Gonotec Salmenkipp Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner Plasma Etch PE-Avenger
Polycarbonate filter Cytiva Whatman Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 355647
Pyranine Acros Organics H1529-1G
Quartz cuvette (black) Hellma Analytics 108B-10-40
Sephadex G-75 resin  GE Healthcare 17-0050-01
Sonicator Sonics Sonics & Materials INC Sonics vibra cell
Syringe filter Sarstedt Filtropur S plus 0.2 0.2 µm
Syringe pump Harvard Apparatus A-42467
Tabletop centrifuge Eppendorf centrifuge 5418
Teflon spacer Homemade  Teflon based 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris PanReac AppliChem A1086.1000
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100 ml
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima Max-E
UV lamp Spectroline ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer Jasco V730 spectrophotometer
Valinomycin Sigma-Aldrich V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope Zeiss AxioObserver
β-Casein Sigma Aldrich C5890-500g

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References

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Réseaux métaboliques hors équilibre reconstitution de protéines membranaires grandes vésicules unilamellaires (LUV) vésicules unilamellaires géantes (GUV) bioréacteurs capteurs basés sur la fluorescence encapsulation enzymatique encapsulation de métabolites
Construction de réseaux métaboliques hors équilibre dans des vésicules de taille nanométrique et micrométrique
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Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, … More

Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, B. Construction of Out-of-Equilibrium Metabolic Networks in Nano- and Micrometer-Sized Vesicles. J. Vis. Exp. (206), e66627, doi:10.3791/66627 (2024).

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