Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Konstruktion av metaboliska nätverk ur jämvikt i nano- och mikrometerstora vesiklar

Published: April 12, 2024 doi: 10.3791/66627
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Groningen

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att rekonstituera membranproteiner och kapsla in enzymer och andra vattenlösliga komponenter i lipidvesiklar av submikrometer- och mikrometerstorlek.

Abstract

Vi presenterar en metod för att inkorporera komplexa proteinnätverk i vesiklar, som involverar integrerade membranproteiner, enzymer och fluorescensbaserade sensorer, med hjälp av renade komponenter. Denna metod är relevant för design och konstruktion av bioreaktorer och för studier av komplexa nätverk för metaboliska reaktioner utanför jämvikt. Vi börjar med att rekonstruera (multipla) membranproteiner till stora unilamellära vesiklar (LUVs) enligt ett tidigare utvecklat protokoll. Vi kapslar sedan in en blandning av renade enzymer, metaboliter och fluorescensbaserade sensorer (fluorescerande proteiner eller färgämnen) via freeze-thaw-extrudering och avlägsnar icke-inkorporerade komponenter genom centrifugering och/eller storleksuteslutningskromatografi. Prestandan hos de metaboliska nätverken mäts i realtid genom att övervaka ATP/ADP-förhållandet, metabolitkoncentrationen, internt pH eller andra parametrar genom fluorescensavläsning. Våra membranproteininnehållande vesiklar med en diameter på 100-400 nm kan omvandlas till jätte-unilamellära vesiklar (GUV), med hjälp av befintliga men optimerade procedurer. Metoden gör det möjligt att inkludera lösliga komponenter (enzymer, metaboliter, sensorer) i mikrometerstora vesiklar, vilket ökar volymen av bioreaktorerna med storleksordningar. Det metaboliska nätverket som innehåller GUV:er fångas i mikrofluidiska enheter för analys med optisk mikroskopi.

Introduction

Området bottom-up syntetisk biologi fokuserar på att konstruera (minimala) celler 1,2 och metaboliska bioreaktorer för bioteknologiska 3,4 eller biomedicinska ändamål 5,6,7,8. Konstruktionen av syntetiska celler ger en unik plattform som gör det möjligt för forskare att studera (membran)proteiner under väldefinierade förhållanden som efterliknar dem i naturliga miljöer, vilket möjliggör upptäckt av emergenta egenskaper och dolda biokemiska funktioner hos proteiner och reaktionsnätverk9. Som ett mellansteg mot en autonomt fungerande syntetisk cell utvecklas moduler som fångar upp väsentliga egenskaper hos levande celler såsom metabolisk energibevarande, protein- och lipidsyntes och homeostas. Sådana moduler förbättrar inte bara vår förståelse av livet utan har också potentiella tillämpningar inom områdena medicin8 och bioteknik10.

Transmembranproteiner är kärnan i praktiskt taget alla metaboliska nätverk eftersom de transporterar molekyler in eller ut ur cellen, signalerar och svarar på miljöns kvalitet och spelar många biosyntetiska roller. Således kräver konstruktionen av metaboliska moduler i syntetiska celler i de flesta fall rekonstituering av integrerade och/eller perifera membranproteiner till ett membrandubbelskikt som består av specifika lipider och hög integritet (låg permeabilitet). Hanteringen av dessa membranproteiner är utmanande och kräver specifik kunskap och experimentella färdigheter.

Flera metoder har utvecklats för att rekonstruera membranproteiner i fosfolipidvesiklar, oftast i syfte att studera funktionen11,12, reglering13, kinetiska egenskaper14,15, lipidberoende15,16 och/eller stabilitet17 hos ett specifikt protein. Dessa metoder innefattar snabb utspädning av tvättmedelslösligt protein till vattenhaltigt medium i närvaro av lipider18, avlägsnande av tvättmedel genom inkubation av tvättmedelslösligt protein med detergentdestabiliserade lipidvesiklar och absorption av tvättmedlet eller tvättmedlen på polystyrenpärlor19, eller avlägsnande av rengöringsmedel genom dialys eller storleksuteslutningskromatografi20. Organiska lösningsmedel har använts för att bilda lipidvesiklar, till exempel genom bildandet av olje-vatten-interfaser21, men majoriteten av integrerade membranproteiner inaktiveras när de utsätts för sådana lösningsmedel.

I vårt laboratorium rekonstituerar vi mestadels membranproteiner med tvättmedelsabsorptionsmetoden för att bilda stora unilamellära vesiklar (LUV)19. Denna metod gör det möjligt att samtidigt rekonstituera flera membranproteiner och kapsla in enzymer, metaboliter och sonder22,23 i vesikellumen. De membranproteininnehållande LUV:erna kan omvandlas till jätte-unilamellära vesiklar (GUV) med/utan inkapsling av vattenlösliga komponenter, med hjälp av antingen elektroformation24 eller gelassisterad svullnad25 och specifika förhållanden för att bevara integriteten hos membranproteinerna26.

Denna artikel presenterar ett protokoll för rekonstituering i LUV:er av ett metaboliskt nätverk som är ur jämvikt och som regenererar ATP genom nedbrytning av L-arginin till L-ornitin27. Bildningen av ATP är kopplad till produktionen av glycerol-3-fosfat (G3P), en viktig byggsten för fosfolipidsyntes22,28. Den metaboliska vägen består av två integrerade membranproteiner, en arginin/ornitin (ArcD) och en G3P/Pi-antiporter (GlpT). Dessutom krävs tre lösliga enzymer (ArcA, ArcB, ArcC) för återvinning av ATP, och GlpK används för att omvandla glycerol till glycerol-3-fosfat, med hjälp av ATP från nedbrytningen av L-arginin, se figur 1 för en schematisk översikt över vägen. Detta protokoll representerar en bra utgångspunkt för den framtida konstruktionen av ännu mer komplexa reaktionsnätverk - för syntes av lipider eller proteiner eller delning av celler. Lipidsammansättningen i vesiklarna stöder aktiviteten hos en mängd olika integrerade membranproteiner och har optimerats för transport av olika molekyler in i eller ut ur vesiklarna 27,29,30.

Figure 1
Figur 1: Översikt över vägen för ATP-produktion och syntes och utsöndring av glycerol-3-fosfat. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kort sagt, renade membranproteiner (solubiliserade i dodecyl-β-D-maltosid, DDM) tillsätts till förformade lipidvesiklar som har destabiliserats med Triton X-100, vilket gör det möjligt att föra in proteinerna i membranet. Tvättmedelsmolekylerna avlägsnas därefter (långsamt) genom tillsats av aktiverade polystyrenpärlor, vilket resulterar i bildandet av väl förseglade proteoliposomer. Lösliga komponenter kan sedan tillsättas till vesiklarna och kapslas in via frys-upptiningscykler, vilket fångar molekylerna i processen för membranfusion. De erhållna vesiklarna är mycket heterogena och många är multilamellära vesiklar. De extruderas sedan genom ett polykarbonatfilter med en porstorlek på 400, 200 eller 100 nm, vilket ger mer jämnt dimensionerade vesiklar; Ju mindre porstorlek, desto mer homogena och unilamellära vesiklar men till priset av en mindre inre volym. Icke-inkorporerade proteiner och små molekyler avlägsnas från den externa lösningen genom storleksuteslutningskromatografi. ProteoLUV:erna kan omvandlas till vesiklar i mikrometerstorlek genom gelassisterad svullnad, och dessa proteoGUV:er samlas sedan in och fångas i ett mikrofluidiskt chip för mikroskopisk karakterisering och manipulation. Figur 2 visar en schematisk översikt över det fullständiga protokollet.

Figure 2
Figur 2: Översikt över protokollet för rekonstituering av membranproteiner och inkapsling av enzymer och vattenlösliga komponenter i lipidvesiklar av submikrometer (LUV) och mikrometerstorlek (GUV). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Rekonstituerings- och inkapslingsprotokollen fungerar bra och proteinernas funktionalitet bibehålls, men proteoLUV:erna och proteoGUV:erna är heterogena i storlek. Mikrofluidiska metoder 31,32 tillåter bildandet av mikrometerstora vesiklar som är mer homogena i storlek, men funktionell rekonstitution av membranproteiner är i allmänhet inte möjlig eftersom kvarvarande lösningsmedel i dubbellagret inaktiverar proteinerna. ProteoLUV:erna varierar i storlek från 100 till 400 nm, och vid låga koncentrationer av enzymer kan inkapslingen leda till vesiklar med ofullständiga metaboliska vägar (stokastiska effekter; se figur 3). LUV:er är idealiska för att konstruera specifika metaboliska moduler, som visas här för produktion av ATP och byggstenar som G3P. Sådana proteoLUV:er kan potentiellt kapslas in i GUV:er och fungera som organellliknande fack för värdvesiklarna.

Figure 3
Figur 3: Antal molekyler per vesikel med en diameter på 100, 200 eller 400 nm. (A) När de inkapslade proteinerna (enzymer, sonder) ligger i intervallet 1-10 μM. (B) Beredningen görs vid 1 till 1 000, 1 till 10 000 och 1 till 100 000 membranproteiner per lipid (mol/mol). Vi gör antagandet att molekyler är inkapslade vid de angivna koncentrationerna och inkorporeras i membranet vid dessa protein-till-lipid-förhållanden. För vissa enzymer har vi sett att de binder till membran, vilket kan öka deras skenbara koncentration i vesiklarna. Förkortning: LPR = Lipid-Protein-Ratio Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Allmän förberedelse

  1. Kemikalier
    1. Lös upp lipider (i pulverform) till 25 mg/ml i CHCl3 för att göra förformade liposomer.
      OBS: Det är att föredra att förbereda färska lipidlager, men stamlösningarna kan också förvaras vid -20 °C i några veckor. Att arbeta med lipider i pulverform är mer exakt än att använda lipider som redan är solubiliserade i CHCl3. CHCl3 ska hanteras med hjälp av glaspipetter och/eller sprutor och förvaras i glasbehållare eftersom CHCl3 löser upp plast.
    2. Lös upp små molekyler (nukleotider, aminosyror, fluorescenssonder) för inkapslingsproceduren i 50 mM KPi (buffert A, se tabell 1) och justera pH till 7,00 ± 0,01. Lös upp MgCl2 i avjoniserat vatten för att undvika att magnesiumfosfat fälls ut.
      OBS: Stamlösningar kan förvaras vid -20 °C i några veckor, med undantag för DTT, som bereds färskt på dagen för experimentet.
    3. Lös upp jonoforer (t.ex. valinomycin, nigericin) i antingen DMSO eller EtOH vid en stamkoncentration på 100-500 μM. Förvaras vid -20 °C i några veckor; Undvik avdunstning.
      OBS: DMSO är inte flyktigt och är därför att föredra framför EtOH. Använd injektionsflaskor av glas istället för plast för att undvika att jonoforerna fäster på ytan av injektionsflaskorna.
  2. Buffertar
    1. Förbered nya buffertar samma dag som försöket utförs (tabell 1). Förvara inte längre än 24 timmar.
  3. Rening av lösliga proteiner
    1. Express ArcA, ArcB, ArcC (vi använder en specifik variant som heter ArcC1), PercevalHR och GlpK som beskrivits tidigare 27,28,33. Se till att tillsätta 10 % v/v glycerol till celllysbufferten, vilket förbättrar stabiliteten hos proteinerna. Rena de lösliga proteinerna enligt beskrivningen 27,28,33 och som kortfattat rapporteras nedan.
    2. Tina 10 ml celllysat (~5 g våtvikt) i ett isvattenbad. Applicera under tiden 2 ml (1 CV) Ni2+-Sepharose-harts på en gravitationskolonn (20 ml kapacitet) med avjoniserat vatten (12 CV) och buffert B (4 CV) för att tvätta. Överför det tinade lysatet till is; Arbete på is, om inget annat anges.
    3. Tillsätt imidazol till en slutlig koncentration av 10 mM till det tinade lysatet och häll sedan lösningen på gravitationsflödeskolonnen. Inkubera i 1 timme vid 4 °C med mild nutation.
    4. Efter 1 timme, kassera genomströmningen och tvätta hartset med buffert C (20 CV).
    5. Eluera proteinet med Buffer D. Använd 60 % CV för det första elueringssteget, följt av 4-6 steg med 40 % CV.
    6. Bestäm proteinkoncentrationen och tillsätt Na-EDTA till en slutlig koncentration på 5 mM.
    7. Snurra ner det renade proteinet i en kyld bordscentrifug (maxhastighet, 10 minuter, 4 °C). Rena genom storleksuteslutningskromatografi med Buffer E. Poola ihop elueringsfraktionerna och koncentrera dem till ~10 mg/ml med ett koncentreringsfilter med en cut-off på 30 kDa. Bered alikvoter av lämplig storlek (~ 20 μL), snabbfrys med flytande kväve och förvara vid -80 °C för senare användning.
      OBS: Det är viktigt att koncentrera enzymerna till 50-100 μM för att minimera den volym som behövs för inkapslingen.
  4. Rening av membranproteiner
    1. Overexpress ArcD och GlpT som beskrivits tidigare 22,27,33. Se till att tillsätta 10 % v/v glycerol till celllysbufferten; för rening av ArcD, inkludera 2 mM reduktionsmedel (t.ex. DTT) i bufferten. Rena de affinitetsmärkta proteinerna med Ni2+-Sepharose-kromatografi.
      1. Tina en alikvot av råmembranvesiklar (10-20 mg totalt membranprotein) i ett isvattenbad.
        OBS: När du har tinat, arbeta alltid på is om inget annat anges. Se tabell 1 för de buffertar som används i det här avsnittet.
      2. Tillsätt membranvesiklarna till buffert F (ArcD) eller buffert G (GlpT) till en slutlig volym på 6 ml. Inkubera provet i 1 timme vid 4 °C med mild nutation.
      3. Separera de solubiliserade membranproteinerna från membranresterna genom ultracentrifugering (337 000 × g, 30 min, 4 °C). Applicera under tiden 0,25 ml (1 CV) Ni2+-Sepharose-harts på en gravitationskolonn (10 ml kapacitet) med avjoniserat vatten (40 CV) och 20 CV buffert H (ArcD) eller buffert I (GlpT).
      4. Häll det solubiliserade proteinet på gravitationskolonnen och tillsätt imidazol till en slutlig koncentration av 10 mM. Inkubera i 1 timme vid 4 °C med mild nutation.
      5. Efter 1 timme, kassera genomströmningen och tvätta hartset med 20 CV av Buffer J (ArcD) eller Buffer K (GlpT).
      6. Eluera membranproteinet i steg om 60 % CV (1st) och 40 % CV (2:a-6:e) med Buffer L (ArcD) eller Buffer M (GlpT).
      7. Bestäm proteinkoncentrationen och fortsätt till avsnitt 2.2. för beredning av membranen.
        OBS: Den storleksuteslutande reningen utförs inte nödvändigtvis för membranproteiner eftersom membranrekonstitueringen ger en liknande rening. Steg 1.4 och 2.2 kan utföras på 1 arbetsdag. Börja med proteinrening (steg 1.4) på morgonen och fortsätt med beredning (steg 2.2) på eftermiddagen. Beredningen avslutas följande dag (se avsnitt 2.2 för detaljer). STOPPPUNKT: Renad och DDM-solubliserad ArcD och GlpT kan lagras vid -80 °C för senare användning, men detta är inte sant för alla membranproteiner. Bered alikvoter av lämplig storlek (50–200 μL), snabbfrys med flytande kväve och förvara vid -80 °C för senare användning. Dessa proteiner är aktiva i flera månader när de förvaras vid -80 °C i närvaro av 10 % v/v glycerol.
  5. Beredning av β-kasein för passiveringsändamål
    1. Blanda 100 mg β-kasein på nytt i 20 ml avjoniserat vatten och titrera med 1 M NaOH tills β-kaseinet är helt upplöst. Tillsätt sedan 1 M ättiksyra för att justera pH-värdet till 7,0 och fyll volymen till 50 ml med avjoniserat vatten. Filtrera lösningen genom ett 0,2 μm sprutfilter och gör alikvoter på 500 μL.
      OBS: β-kaseinet kan förvaras vid -20 °C i 6 månader. Det rekommenderas att filtrera β-kaseinet igen före användning för att undvika att β-kaseinaggregat täpper till mikrofluidchipet.

Buffert Sammansättning
Buffert A 50 mM KPi pH 7,0
Buffert B 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10 % v/v glycerol, 10 mM imidazol, pH 7,5
Buffert C 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10 % v/v glycerol, 50 mM imidazol, pH 7,5
Buffert D 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10 % v/v glycerol, 500 mM imidazol, pH 7,5
Buffert E 50 mM KPi, 100 mM KCl, 10 % v/v glycerol, pH 7,0
Buffert F 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,5 % vikt/volym, glycerol 10 %, glycerol, 2 mM β-merkaptoetanol, pH 7,5
Buffert G 50 mM Tris-HCl, 0,5 % vikt/volym DDM, 20 % v/v glycerol, pH 8
Buffert H 50 mM KPi, 100 mM KCl, 0,02 % w/v DDM, 10 % v/v glycerol, 2 mM β-merkaptoetanol, 10 mM imidazol, pH 7,5
Buffert I 50 mM Tris-HCl, 0,04 % vikt/volym DDM, 20 % v/v glycerol, 10 mM imidazol, pH 8,0
Buffert J 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02 % vikt/volym DDM, 10 % v/v glycerol, 2 mM β-merkaptoetanol, 50 mM imidazol, pH 7,5
Buffert K 50 mM Tris-HCl, 0,04 % vikt/volym DDM, 20 % v/v glycerol, 50 mM imidazol, pH 8
Buffert L 50 mM KPi, 200 mM KCl, 0,02 % vikt/volym DDM, 10 % v/v glycerol, 2 mM β-merkaptoetanol, 500 mM imidazol, pH 7,5
Buffert M 50 mM Tris-HCl, 0,04 % vikt/volym DDM, 20 % v/v glycerol, 500 mM imidazol, pH 8
Buffert N 50 mM KPi, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0
Buffert O 50 mM KPi, 0,5 mM L-ornitin, 10 mM Na-ADP, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, pH 7,0
Buffert P 50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, x mM glukos (x varieras för att matcha osmolariteten hos det externa och interna mediet)
Buffert Q 50 mM KPi pH 7,0, 0,5 mM sackaros, 2 mM DTT
Buffert R 50 mM KPi pH 7,0, 2 mM DTT, 10 mM L-arginin, x mM glukos

Tabell 1: Buffertar som används i det här protokollet.

2. Proteoliposomer: rekonstituering av renade membranproteiner till förformade lipidvesiklar

  1. Dag 1
    1. Beredning av förformade lipidvesiklar
      1. Välj lipidsammansättning (t.ex. syntetiska fosfolipider, polära E. coli-lipider ) på grundval av membranproteinernas krav.
        OBS: En blandning av DOPE, DOPG och DOPC (25:25:50 mol%) är en bra utgångspunkt, men steroler eller kardiolipin kan krävas för vissa proteiner; För jästplasmamembranproteiner inkluderar vi palmitoyl-oleoyllipider istället för dioleoyl30. En blandning av DOPE, DOP och DOPC (25:25:50 mol%) räcker för rekonstituering av ArcD och GlpT.
      2. Blanda de önskade lipiderna (solubiliserade i CHCl3) och förånga CHCl3 i en roterande förångare tills en lipidfilm bildas. Tvätta lipiderna genom att tillsätta dietyleter i samma volym som CHCl3. Indunsta dietyleter och få en torr lipidfilm.
      3. Återsuspendera lipidfilmen till 20 mg/ml totala lipider i vattenhaltiga medier (buffert A). Börja med hälften av den totala volymen och skaka försiktigt; Överför sedan försiktigt lipiderna till ett rent rör eller en flaska av lämplig storlek. Tillsätt ny buffert A i kolven och upprepa proceduren för att lösa upp de återstående lipiderna och överföra dem till ett nytt kärl. Tillsätt ytterligare buffert A för att nå en slutlig koncentration på 20 mg/ml.
      4. Ultraljudsbehandla de resuspenderade lipiderna med hjälp av en sond sonicator. Använd följande parametrar för en ultraljudsapparatspets med en diameter på 6 mm: 4 μm intensitet, 70% amplitud, 5 s på, 45 s av, 16 cykler. Sänk ner lipiderna i ett isvattenbad som innehåller EtOH för att undvika överhettning genom ultraljudsbehandling.
      5. Snabbfrys det ultraljudsbehandlade provet (volym 40 ml i ett 50 ml centrifugrör) i flytande kväve och tina provet i ett vattenbad vid rumstemperatur. Upprepa en gång; alikvotera sedan liposomerna i önskade volymer (t.ex. 1 ml eller 20 mg totala lipider i ett 1,5 ml plaströr).
        STOPPPUNKT: Proceduren kan stoppas vid denna tidpunkt. Snabbfrys varje alikvot en gång till (tredje cykeln) och förvara i flytande kväve i upp till några månader. Se till att sticka hål i tublocken två gånger med en nål för att undvika att röret exploderar vid snabb kokning av det flytande kvävet.
  2. Dag 2
    1. Rekonstituering av renade membranproteiner till förformade liposomer
      1. Tina en alikvot liposomer (totalt 20 mg lipider) i ett vattenbad vid rumstemperatur. Under tiden, förbered en extruder genom att applicera ett valfritt filter (t.ex. polykarbonat, pordiameter på 400 nm); i förjämvikt mellan extrudern och buffert A; och ladda de tinade liposomerna ("mjölklösning") i extrudern och passera dem 13 gånger genom filtret. Samla de extruderade liposomerna (nu stora unilamellära vesiklar; "ogenomskinlig lösning") i ett glas- eller plastkärl av lämplig storlek (t.ex. 15 ml). Späd liposomerna till 4 mg/ml med buffert A kompletterad med 2 mM DTT.
      2. Överför 1 ml 4 mg/ml liposomer till en 1 ml genomskinlig kyvett. Mät den initiala optiska densiteten vid 540 nm i en spektrofotometer. Häll tillbaka det uppmätta provet och tillsätt 50 μL 10 % v/v Triton X-100 till liposomerna.
        OBS: En titreringsvolym på 50 μL av 10 % Triton-X100 är lämplig för 20 mg lipider i en volym av 5 ml; tillsatsen av Triton X-100 kommer att späda ut lipiderna med ~5%. Justera titreringsvolymen när du arbetar med olika mängder liposomer. För stabila optiska densitetssignaler, titrera liposomerna med Triton X-100 vid rumstemperatur.
      3. Upprepa steg 2.2.1.2 och notera när en maximal optisk densitet har uppnåtts (Rsat). Fortsätt med titreringen tills en optisk densitet på cirka 60 % Rsat uppnås (Figur 4). Häll tillbaka de tvättmedelsdestabiliserade vesiklarna i glas-/plaströret (den slutliga volymen är nu cirka 5.2 ml), överför provet till is och låt det svalna.
      4. Tillsätt de renade membranproteinerna till de destabiliserade liposomerna för att uppnå ett önskat lipid-till-protein-förhållande (vikt/vikt). Använd ett förhållande på 400:1 ner till 100:1 w/w; eftersom både ArcD och GlpT har molekylvikter på ~55 kDa, motsvarar ett lipid-till-protein-förhållande på 400:1 w/w ~30 000 lipider per protein och ~ 50 molekyler av ArcD och GlpT vardera per vesiklar med en diameter på 400 nm.
        OBS: Här använder vi 400:1 w/w, vilket motsvarar 50 μg av varje protein per 20 mg lipider.
      5. Nutera proverna vid 4 °C i 15 minuter så att membranproteinerna kan tränga in i det destabiliserade liposommembranet.
      6. För att ta bort tvättmedlet, tillsätt 200 mg torra polystyrenpärlor, beredda enligt tillverkarens instruktioner. Nutate vid 4 °C i ytterligare 15 min.
        OBS: En mängd på 200 mg torra pärlor är lämplig för 20 mg lipider men bör justeras när en annan provstorlek används.
      7. Upprepa steg 2.2.1.6 2x, för totalt tre tillsatser av polystyrenpärlor. Inkubera sedan över natten vid 4 °C med mild nutation.
  3. Dag 3
    1. Upprepa steg 2.2.1.6. Men den här gången, nutate vid 4 °C i 1 timme.
    2. Fäst en tom gravitationskolonn (10 ml kapacitet) ovanför ett tomt 6,5 ml ultracentrifugeringsrör på is. Häll provet i kolonnen och samla upp proteoliposomerna i ultracentrifugeringsröret (pärlorna hålls kvar i kolonnen).
    3. Tvätta pärlorna med 0,5 ml buffert A kompletterad med 2 mM DTT och samla upp filtratet i ultracentrifugeringsröret.
    4. Koncentrera proteoliposomerna genom ultracentrifugering (337 000 × g, 30 min, 4 oC). Återsuspendera proteoliposomerna i en total volym på 200 μL (100 mg lipid/ml) i buffert A kompletterad med 2 mM DTT; den torra volymen av vesiklarna efter centrifugering är ~40 till 120 μL27. Dela upp i alikvoter av önskad storlek (t.ex. tre alikvoter på 6,66 mg totala lipider).
      OBS: Alikvotstorleken är godtycklig men kommer att påverka pelletstorleken i senare steg (se steg 3.2.3.1). STOPPPUNKT: Proceduren kan stoppas här. Snabbfrys varje alikvot och förvara i flytande kväve i upp till några veckor. Var noga med att sticka hål på tubens lock två gånger med en nål för att undvika explosion av röret vid snabb kokning av det flytande kvävet.

Figure 4
Figur 4: Titrering av förformade liposomer med Triton X-100. Liposomer vid 5 mg lipider/ml extruderas genom ett polykarbonatfilter (400 nm) i 50 mM KPi (pH 7,0) och titreras sedan med Triton X-100 (protokollsteg 2.2.1.2). Visiklarnas grumlighet mäts vid A540. Pilen indikerar den Triton X-100-koncentration vid vilken vesiklarna är tillräckligt destabiliserade för spontan insättning av membranproteiner enligt beskrivningen i19. Klicka här för att se en större version av denna figur.

3. Inkapsling av ett metaboliskt nätverk för ATP-återvinning och glycerol 3-P-syntes i vesiklar av submikronstorlek

  1. Dag 1
    1. Blandning av komponenter
      1. För en standardinkapsling, använd 66,6 μl proteoliposomer i en slutlig volym på 200 μL (33,33 mg/ml totala lipider). Beräkna volymen av varje komponent (enzym, kofaktor) som behövs för att uppnå önskad koncentration, tillsätt dessa komponenter till proteoliposomerna och justera volymen till 200 μL med buffert A (tabell 2).
        OBS: Proteinkoncentrationen kan justeras baserat på experimentuppställningen. Det bör dock vara viktigt att se till att det i genomsnitt finns flera kopior (>10) av varje enzym per vesikel, för att undvika oönskade stokastiska effekter. Koncentrationer > 1 μM är i allmänhet säkra. 1 μM i en vesikel med en diameter på 400 nm motsvarar ungefär 20 kopior (figur 3).
      2. Pipettera buffert A i ett tomt 1,5 ml rör och tillsätt DTT, Na-ADP, MgCl2, L-ornitin (och pyrenin, om det behövs för interna pH-mätningar). Tillsätt sedan enzymerna och blanda försiktigt. Tillsätt lösningen ovanpå de förformade proteoliposomerna och virvla kort vid låg hastighet.
        OBS: Det är viktigt att tillsätta Na-ADP före MgCl2 för att undvika oönskad bildning av magnesiumfosfatutfällningar. Vortexing krävs för korrekt blandning av den viskösa lösningen; Minimera dock varaktigheten och hastigheten för att undvika mekanisk skada på proteinerna. PercevalHR och pyranin kan inte samkapslas in eftersom deras spektra överlappar varandra.
    2. Bestämning av inre osmolalitet
      1. Bered en 50 μL-lösning enligt beskrivningen i steg 3.1.1.1 men utan proteoliposomer och mät osmolaliteten med en fryspunktsosmometer.
      2. Bered en kalibreringskurva med hjälp av buffert (50 mM KPi pH 7,0) och varierande koncentrationer av salt (t.ex. NaCl eller NaCl) eller socker. Bestäm den osmolytkoncentration som matchar den inre osmolaliteten (buffert N).
        OBS: Membranpermeabla komponenter (t.ex. glycerol) kan inte användas för att matcha den inre osmolaliteten. För proteiner som är solubiliserade i glycerolinnehållande buffert (t.ex. buffert E) bör samma buffert användas utan glycerol. Den osmolyt som väljs för framställning av en isoosmotisk extern buffert bör vara membranogenomtränglig och inte störa det metaboliska nätverket.
    3. Frys-tina
      1. Snabbfrys (i flytande kväve) proteoliposomerna tillsammans med de lösliga komponenterna och tina i ett vatten-isbad vid cirka 10 °C.
      2. Upprepa steg 3.1.3.1 för totalt 5x.
        STOPPPUNKT: Proceduren kan stoppas här. Hoppa över det sista upptiningssteget och förvara det frysta provet i flytande kväve i 1-3 dagar. Var noga med att sticka hål på tublocken 2x med en nål för att undvika explosion av röret vid snabb kokning av det flytande kvävet. Förvaring i flytande kväve är att föredra över -80 °C för att minimera lipidoxidation.
  2. Dag 2
    1. Extrudering
      OBS: Alla extruderingssteg utförs vid rumstemperatur, eftersom de gastäta sprutorna annars kommer att läcka.
      1. Förbered en extruder genom att använda ett valfritt filter (t.ex. polykarbonat, pordiameter på 400 nm). Tvätta extrudern med en lösning som innehåller samma buffert och metaboliter som används för inkapsling av vesiklarna (t.ex. buffert O plus 0,1 mM pyranin).
        OBS: Använd en dedikerad extruder för att ladda proteoliposomer med pyranin eftersom färgämnet fastnar på extruderns yta och kan orsaka kontaminering i senare prover.
      2. Ladda inkapslingsblandningen i extrudern och passera den genom filtret 13x. Samla upp den extruderade lösningen i ett 1,5 ml rör.
    2. Storleksuteslutningskromatografi (valfritt)
      OBS: Detta steg utförs för att avlägsna externa molekyler såsom färgämnen som pyranin genom storleksuteslutningskromatografi. Om färgämnen inte finns i systemet och andra komponenter inte stör vid låga koncentrationer (observera att vesiklarna efteråt också tvättas genom ultracentrifugering), steg 3.2.2. kan hoppas över.
      1. Återfukta Sephadex G-75-harts och häll det i en glaspelare (22 cm lång, 1,5 cm bred). Balansera hartset med ett överskott av extern buffert (t.ex. buffert N).
      2. Ladda de extruderade proteoliposomerna från steg 3.2.1.2 på den förekvilibrated storleksuteslutningskromatografikolonnen och applicera ett gravitationsflöde av extern buffert. Kassera tomrumsvolymen (cirka 7 ml); Samla sedan in tio 1 ml alikvoter. Visualisera de proteoliposominnehållande alikvoter genom kort exponering för en UV-lampa. Poola de fraktioner som innehåller de flesta proteoliposomerna (2-4 ml).
    3. Tvätt och resuspension
      1. Tvätta de extruderade proteoliposomerna genom ultracentrifugering. Fyll ett 6,5 ml ultracentrifugeringsrör med 5,8 ml buffert N och applicera det extruderade provet ovanpå. Om storleksuteslutningskromatografi utfördes, fyll röret med de poolade elueringsproverna (2–4 ml) och tillsätt buffert N till en slutlig volym på 6 ml.
      2. Centrifugera vid 337 000 × g, 30 min, 4 °C. Kassera supernatanten och torka ultracentrifugeringsröret noggrant med en dammfri vävnad samtidigt som du är uppmärksam på att inte röra pelleten. Återsuspendera pelleten i en liten volym buffert N (200 μL). När pelleten är helt återupplöst, fyll röret upp till 6 ml med buffert N.
        OBS: Att suspendera pelleten kommer att ta tid och bör göras försiktigt.
      3. Upprepa steg 3.2.3.1-3.2.3.2 2 gånger för totalt tre tvättar, såvida inte storleksuteslutningskromatografi utförs (i vilket fall ett centrifugeringssteg räcker). Återsuspendera slutligen pelleten till en önskad koncentration (t.ex. 5,55 mg/ml total lipid) genom att tillsätta en lämplig volym buffert N.
        STOPPPUNKT: Proteoliposomerna kan användas omedelbart eller förvaras vid 4 °C i minst 48 timmar. Storleken på ultracentrifugeringsrören bör väljas baserat på provstorleken. För en pellet med 6,66 mg totala lipider är ett 6,5 ml rör lämpligt. Tvättning av 200 μl proteoliposomer (totalt 33,33 mg lipider/ml; torr pelletvolym ~40 μL)28 för 3 x 6 ml buffert späder ut de externa komponenterna med en faktor 100 för varje tvättsteg. Om rör av olika storlekar används är det önskvärt att justera antalet tvättar därefter.
  3. Dag 3
    1. Detektion av ATP-syntes genom fluorescens
      1. Blanda reaktionskomponenterna till en slutlig volym på 120 μL (tabell 3) i en svart kvartskyvett med ett fönster på 3 x 5 mm och en minsta inre volym på 100 μL.
        OBS: Jonoforer kan tillsättas för att avleda elektrokemiska jongradienter. En blandning av valinomycin och nigericin (1 μM vardera) skingrar effektivt eventuella proton- och kaliumgradienter.
      2. Förvärm provet i en fluorometer inställd på 30 °C och erhåll excitationsspektra av PercevalHR (excitation 400-520 nm, bandbredd 5 nm; emission 550 nm, bandbredd 5 nm). När sondsignalen är konstant, starta det metaboliska nätverket genom att tillsätta ett överskott av L-arginin (5-10 mM) och glycerol (400 μM) när återvinningen av ATP är kopplad till syntesen av glycerol-3-fosfat. Följ reaktionen över tid.
    2. Analys av data
      1. Plotta förhållandet F500/F430 som en funktion av tiden, vilket är en kvalitativ indikator på ATP/ADP-förhållandet. För en mer kvantitativ bedömning av ATP-bildning, konstruera en kalibreringskurva i proteoliposomer eller använd ett komplementärt tillvägagångssätt (t.ex. ATP-kvantifiering genom kemiluminiscens28).
Komponent Slutlig koncentration
Buffert A 50 mM KPi pH 7,0
DTT (DTT) 2 m²
Na-ADP 10 mM
MgCl2 10 mM
L-ornitin 0,5 mM
Fluorescerande sond (PercevalHR eller pyranin) 5,8 μM respektive 0,1 mM
ArcA (arginindeiminas) 1 μM
ArcB (ornitinkarbamoyltransferas) 2 μM
ArcC1 (karbamatkinas) 5 μM
GlpK (glycerolkinas) 1,6 μM
Proteoliposomer 33.33 mg/ml totala lipider

Tabell 2: Inkapslingskomponenter. Komponenterna är listade i den ordning de läggs till. Lösliga proteiner finns i buffert E; alla andra komponenter (utom MgCl2, i avjoniserat vatten) finns i buffert A.

Komponent Slutlig koncentration
Buffert K 50 mM KPi pH 7,0, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,0
Proteoliposomer (5,55 mg/ml lipider) 2,7 mg/ml lipider
Jonoforer (valinomycin, nigericin) 1 μM vardera

Tabell 3: Experimentella betingelser. Komponenterna är listade i den ordning de läggs till. Proteoliposomer finns i buffert N, jonoforer i DMSO eller EtOH.

4. Uppskalning av ett metaboliskt nätverk för mikrometerstora vesiklar

  1. Dag 1
    1. Förberedelse av mikrofluidiska chip
      OBS: Detta experiment använder en mikrofluidisk anordning utvecklad av Robinson et al.34. Andra konstruktioner av mikrofluidiska chips finns tillgängliga 35,36,37 och kan enkelt implementeras i detta protokoll.
      1. Skär av en 200 μL pipettspets en tredjedel från botten och sätt in den nedre delen av spetsen i en förgjord mikrofluidisk fånganordning.
      2. Tillsätt 400 μL β-kaseinlösning (2 mg/ml; se steg 1.5) till chipets inloppsbehållare och se till att luft inte tillförs i detta steg. Placera en hink med 96 brunnar och lägg till en laboratorievävnad i en konisk rörcentrifug på bordsskivan. Placera chipet ovanpå vävnaden och centrifugera i 6 minuter vid 900 × g för att möjliggöra passivering av mikrofluidchipet. Efter centrifugeringssteget ska vätskenivån vara lika på inloppsbehållaren och utloppsspetsen på mikrofluidikchipet; Kontrollera om det finns läckage av chipet. Inkubera β-kaseinlösningen i mikrofluidchipet i minst 30 minuter.
      3. Ta bort det mesta av passiveringslösningen utan att tillföra luft och tillsätt 400 μl tvättbuffert (buffert P). Placera flisen på hinken med 96 brunnar och centrifugera vid 900 × g i 6 minuter. Låt chipset ligga i tvättlösning tills du använder det (i högst 4 timmar).
  2. Gelpreparat för framställning av proteo-GUV:er
    OBS: Följande beskrivning är hämtad och anpassad från25,38.
    1. Lös upp 0,5 % (vikt/vikt) agaros med låg gelningstemperatur (LGT) i avjoniserat vatten genom att värma lösningen i mikrovågsugnen; Se till att agarosen har lösts upp helt och undvik att koka lösningen. Förvara agarosen vid 50 °C tills du använder den igen.
      OBS: Upplöst agaros kan förvaras i rumstemperatur i flera veckor. För att återanvända agarosen, smält helt enkelt gelen med hjälp av en mikrovågsugn.
    2. Ta två objektiva bilder och rita konturerna av distansen på bilderna. Gör objektglasen hydrofila genom plasmarengöring, med hjälp av plasma med hög syrehalt i 1 min.
    3. Tillsätt LGT-agaros ovanpå objektglaset tills det är helt täckt med agaros (~500 μL); Luta sedan sliden i en vinkel på 90 ° och dränera överflödig agaros på en vävnad. Låt objektglasen stå i 30 minuter vid 50 °C.
    4. Ta proteoliposomer som lagras i flytande kväve (avsnitt 3) och tina på is. Späd vesiklarna till 5 mg/ml lipider med hjälp av buffert Q.
      OBS: Proteoliposomer som beretts i avsnitt 3 innehåller inte lösliga proteiner och kan beredas i god tid om de förvaras i flytande kväve. När du arbetar med proteoGUV:er, se till att alltid filtrera de fungerande lösningarna för att förhindra igensättning av mikrofluidikenheten.
    5. Ultraljudsbehandla proteo-liposomerna med hjälp av en handhållen sond sonicator med en 1 mm sond. Ultraljudsbehandling i 10 cykler på 0,5 s på och 0,5 s av vid 70% amplitud. Håll vesiklarna, hädanefter kallade proteoSUVs, på is i 30 s, och upprepa ultraljudsbehandlingsprocessen 5x.
    6. Fyll en 100 μL spruta (i en handhållen LCP-dispenser) med proteo-SUV-suspensionen. Deponera 0,5 μL droppar av proteo-SUV:er på den tidigare beredda agarosgelen; Var försiktig så att du inte stör agaroslagret och håll tillräckligt med avstånd för att förhindra att droppar smälter samman.
      OBSERVERA Genom att använda en handhållen LCP-dispenser kan droppavsättning ske på ett reproducerbart sätt, men alternativa pipetteringssystem kan också användas. Spotting med en glaskapillär är mindre lämplig eftersom det stör den torkade agarosgelén.
    7. Torka SUV-dropparna på ~10 minuter med ett kväveflöde istället för tryckluft för att minska risken för oxidering av lipiderna.
    8. Bered 1 ml av en 1,25 x koncentrerad buffert O (tabell 4) i buffert A och passera genom ett 0,2 μm cellulosaacetatfilter. Ta 800 μl av den 1,25 gånger koncentrerade lösningen och tillsätt de lösliga enzymerna och sonderna till en koncentration som anges i tabell 4. Använd filtrerat avjoniserat vatten för att göra den slutliga volymen 1 ml.
    9. Bered 100 μl svällningslösning som innehåller alla beståndsdelar i tabell 4, med undantag av proteiner och glycerol. Mät osmolaliteten hos svällningslösningen med hjälp av en 3-punkts kalibrerad fryspunktsosmometer.
      OBS: Förbered 100 μL svällningslösning utan protein och glycerol för att exakt bestämma osmolaliteten hos denna lösning. Glycerol, som finns i proteinlösningen, påverkar osmolaliteten, men i GUV:er diffunderar glycerol snabbt över membranet och leder endast till övergående osmotiska skillnader.
    10. Montera GUV-svällningskammaren genom att göra en smörgås av två objektiva glas som innehåller gelén och torkade stadsjeepar med en 1,5 eller 3,0 mm tjock teflondistans emellan. Tillsätt sedan svälllösningen i kammaren genom det lilla hålet i sidan med hjälp av en spruta och nål.
      OBS: Volymen på svällningslösningen kan justeras genom att variera distanserna från 1,5 till 3,0 mm.
  3. Svullnad av vesiklar och skörd av GUV:er
    1. Låt vesiklarna svälla genom att ställa kammaren vid 22 °C i minst 30 minuter.
      OBS: Svullnaden i vesiklarna kan följas med ljusmikroskopi (t.ex. ett faskontrastmikroskop eller ett fluorescensmikroskop med brett fält) om proteinerna eller lipiderna är fluorescerande märkta.
    2. Skörda GUV:erna från gelen genom att applicera mild fysisk omrörning genom att knacka kammaren på en fast yta (t.ex. labbbänk); ta ut en tredjedel av volymen och använd den resulterande luftbubblan för att försiktigt inducera rörelse till den återstående vätskan och därigenom lossa GUV:erna från gelen.
    3. Medan GUV:erna sväller, förbered buffert P och matcha osmolaliteten med svällningslösningen genom att justera koncentrationen av glukos. Filtrera bufferten genom ett 0,2 μm sprutfilter.
      OBS: I allmänhet bör tvätt- och substratlösningen hållas inom ± 5 mosmol/kg. Alla lösningar som passerar genom chipet bör vara mycket rena eftersom föroreningar kan täppa till kanalerna. Gör nya buffertar varje gång eller förvara förberedda buffertar vid -20 °C och filtrera före användning.
  4. Fällor av GUV:er för mikroskopiexperiment
    1. Montera det passiverade mikrofluidiska chipet på provetage av mikroskopetage. Kontrollera om det finns eventuella defekter (t.ex. läckor, instängd luft, igensatta kanaler).
      OBS: Kontroll av spånan kan göras i god tid innan används så att ett nytt spån kan förberedas vid behov.
    2. Anslut slangen med en böjd nål till behållarens utlopp och anslut den andra änden till en 1 ml spruta. Montera sprutan på en pump och ställ in flödeshastigheten på maximalt 10 μL/min.
    3. Ta bort tvättbufferten från behållaren (steg 4.1.1.3) och byt ut den mot ett nytt medium (buffert P). Starta flödet av buffert genom chipet genom att infundera via sprutan vid 1-10 μL/min. Tvätta med minst 80 μL osmotiskt balanserad tvättbuffert (Buffer P).
    4. Ta bort överflödig tvättbuffert från behållaren och tillsätt (proteo)GUV:erna i behållaren. Justera flödeshastigheten till 0,1-1 μL/min för att tillåta GUV:erna att flöda genom chipet. Övervaka chipet över tid tills tillräckligt många GUV:er har fångats i chipet.
      OBS: Vesiklar med relativt stora mängder (>20 mol%) laddade lipider såsom fosfatidylglycerol (PG), fosfatidylserin (PS) eller fosfatidinsyra (PA) eller icke-dubbelskiktsbildande lipider som fosfatidyletanolamin (PE) introduceras med en lägre flödeshastighet genom chipet för att förhindra sprängning. Vesiklar som består av ren fosfatidylkolin (PC) tenderar att vara mer stabila.
    5. Ta bort överflödig GUV-lösning och tillsätt tvättbuffert P, med ett konstant flöde på 0,1–1 μL/min, för att byta ut det externa mediet och tvätta de fångade GUV:erna i minst 1 timme för att avlägsna icke-inkapslade föreningar och sänka bakgrundsfluorescensen när en fluorofor är inkapslad. Övervaka bakgrundsfluorescensen över tid; Om bakgrundsfluorescensen inte minskar kan chippet blockeras.
    6. Lokalisera fällor med tillräckliga mängder vesiklar och spara deras positioner. Tillämpa inställningarna på mikroskopet (t.ex. laserintensitet, förstärkning, våglängd) och starta ett tidsserieexperiment.
    7. Tillsätt osmotiskt balanserad substratlösning (buffert R) till behållaren och starta en flödeshastighet på 0,5 μL/min.

Buffert L-komponenter
Komponent 1,25 x koncentration Koncentration i arbetet
Buffert A 62,5 mM KPi pH 7,0 50 mM KPi pH 7,0
Sackaros 125 m² 100 mM
DTT (DTT) 2,5 m² 2 m²
Na-ADP 12,5 mM 10 mM
MgCl2 12,5 mM 10 mM
L-ornitin 0,625 mM 0,5 mM
Komponenter för inkapsling
Pyranin eller PercevalHR 1 mM eller 20 μM
ArcA (arginindeiminas) 1 μM
ArcB (ornitinkarbamoyltransferas) 2 μM
ArcC1 (karbamatkinas) 5 μM

Tabell 4: Buffert O och inkapslingskomponenter. Komponenterna är listade i den ordning de läggs till. Alla komponenter (utom MgCl2, i avjoniserat vatten) är i buffert A. Inkapslingskomponenter listas i additionsordning. Alla vattenlösliga proteiner finns i buffert E.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rekonstitueringen av solubiliserade membranproteiner i liposomer kräver destabilisering av förbildade vesiklar. Tillsatsen av små mängder Triton X-100 resulterar initialt i en ökning av absorbansen vid 540 nm (A540) på grund av en ökning av ljusspridningen genom svullnad av vesiklarna (figur 4). Det maximala A540-värdet är den punkt där liposomerna är mättade med rengöringsmedel (Rsat), varefter ytterligare tillsats av Triton X-100 kommer att resultera i partiell solubilisering av vesiklarna. Vid Rsol är liposomerna helt solubiliserade (Figur 4). För rekonstituering av membranproteiner använder vi vanligtvis vesiklar som destabiliserats till 60 % över Rsat (indikeras med pil).

Det rekonstituerade membranproteinet ArcD används för att transportera L-arginin in och L-ornitin ut ur vesiklarna och används tillsammans med de inkapslade enzymerna ArcA, ArcB och ArcC för att återvinna ATP från ADP och oorganiskt fosfat. GlpT är en glycerol-3-fosfat/fosfat-antiporter som tillsammans med GlpK behövs för syntes (och utsöndring) av glycerol-3-fosfat från glycerol plus ATP som produceras genom L-argininnedbrytning. Tillsatsen av 5 mM L-arginin vid t = 0 till proteoliposomerna resulterar i en kraftig ökning av förhållandet mellan PercevalHR-fluorescensen vid 500 och 430 nm excitation39, vilket återspeglar ATP/ADP-förhållandet inuti vesiklarna (figur 5). Vid tillsats av glycerol används ATP för syntes av glycerol-3-fosfat, vilket resulterar i en sänkning av ATP/ADP-förhållandet28. Nedbrytningen av L-arginin leder också till pH-förändringar, som kan kvantifieras med hjälp av pyranin eller pHluorin27.

Figure 5
Figur 5: Återvinning av ATP genom nedbrytningsvägen för L-arginin. LUV:er med 2,7 mg lipid/ml placeras i en kyvett och förhållandet mellan fluorescens vid 500 nm och 430 nm registreras. 5 mM L-arginin tillsätts vid t = 0. F500/F430-förhållandet är ett mått på ATP/ADP-förhållandet inuti vesiklarna. Förkortning: LUVs = stora-unilamellära vesiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

De ATP-producerande LUV:erna kan också användas för att bilda GUV:er. Rehydrering av torkade proteo-LUV:er på en LGT-agarosgel resulterar i bildandet av mikrometerstora vesiklar (Figur 6). Bildningen av proteo-GUV:er i de torkade LUV-fläckarna beror i hög grad på den lokala koncentrationen av lipider och graden av uttorkning. Vissa områden har stora fläckar av GUV:er, medan det på andra platser i samma dropp inte kan bildas några eller få GUV:er. Bildandet av GUV:er via LGT-agarosassisterad svullnad resulterar i en rad olika GUV-storlekar, vanligtvis från några mikrometer till mer än 50 μm.

Figure 6
Figur 6: DIC-bilder av proteoGUVs bildade av gelassisterad svullnad. Skalstapel = 25 μm. Förkortningar: DIC = differentiell interferenskontrast; GUVs = jätte-unilammellära vesiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

GUV:erna skördas och fångas i en β-kasein passiverad PDMS-baserad mikrofluidisk anordning (figur 7). Enheten är utformad på ett sätt så att många vesiklar kan fångas och analyseras i ett enda experiment, och enheten används för att kontrollera den yttre miljön (flödeshastighet, buffertsammansättning, etc.) 34. Även när utbytet av proteo-GUV:er är lågt, gör det konstanta flödet av GUV:er genom mikrofluidikchipet att många vesiklar kan samlas in. När tillräckligt många GUV:er har fångats tvättas systemet med en osmotiskt balanserad buffert för att avlägsna externa komponenter som lösliga proteiner, små molekyler och fluorescerande sonder. Tvättbufferten ersätts sedan med en substratlösning med samma osmolalitet innehållande 50 mM KPi (pH 7,0), varierande mängder glukos (för att justera osmolaliteten) och substrat som 10 mM L-arginin. Ett tidsserieexperiment görs på flera fällor i det mikrofluidiska chipet och bilder tas var 90:e sekund (405 nm och 488 nm excitation när PercevalHR används). Vidare tas en ljusfältsbild vid varje tidpunkt. Förhållandet mellan emissionsintensiteterna efter excitation vid 488 och 405 nm är ett mått på ADP/ATP-förhållandet i vesiklarna.

Figure 7
Figur 7: Infångning av vesiklar med mikrofluidikchipet. (A) Infångning av vesiklarna, åtföljd av förmågan att kontrollera den yttre miljön och flödeshastigheten. (B) ProteoGUV:er fångade i en mikrofluidisk enhet och exciterade med en 405 nm laser (grön) och 488 laser (röd). Emission för båda kanalerna mäts vid >500 nm. Ljusfältsbilden gör det möjligt att visualisera vesiklarna utan fluorescens. Skalstapel = 25 μm. Förkortning: GUVs = giant-unilamellar vesicles. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterar ett protokoll för syntes av (membran)protein som innehåller lipidvesiklar med submikrometerstorlek (proteoLUVs), och omvandlingen av proteoLUVs till giant-unilamellära vesiklar (proteoGUVs). Protokollet bör vara tillämpligt för rekonstituering av andra membranproteiner 13,19,30,40 och inkapsling av andra metaboliska nätverk än de L-argininnedbrytnings- och glycerol-3-fosfatsyntesvägar som presenteras här.

Rekonstitueringen av membranproteiner i liposomer ger i allmänhet en slumpmässig orientering av proteinerna i lipidmembranet. För ArcD och Glpt spelar orienteringen ingen roll, eftersom proteinerna fungerar dubbelriktat och de lösta ämnena rör sig beroende på tecknet på den totala elektrokemiska potentialen. För proteiner som fungerar i en riktning kommer hälften av molekylerna inte att vara tillgängliga för aktivitet när deras orientering är 50/50.

Extruderingen av vesiklar genom ett polykarbonatfilter minskar storleksfördelningen, och vesiklarna blir mer homogena ju mindre porstorleken på filtren är. Mindre vesiklar kommer dock till priset av att ha en mindre volym och därmed ett mycket litet antal proteiner (enzymer, membranproteiner) per vesikel. För att minimera andelen LUV:er som saknar en eller flera komponenter kan koncentrationen av proteinerna justeras som visas i figur 3A,B, men med mycket små vesiklar är stokastiska effekter oundvikliga.

Den gelassisterade svällningsmetoden bygger på avsättning av sonikerade vesiklar (SUV) på en torkad agarosyta. Under torkningsprocessen bildas en koncentrationsgradient av vesiklar och lipidkoncentrationen är den högsta i platsens periferi. Detta beror på ett fenomen som kallas kaffefläckseffekten41,42. Som ett resultat innehåller endast ett litet område inom fläcken en koncentration av lipider som är lämpliga för GUV-bildning. Cirkulära ojämnt koncentrerade lipidfläckar resulterar i stora oanvända områden som inte är tillgängliga för vesikelfusion; därför blir effektiviteten i GUV-bildningen låg i detta tillvägagångssätt. För att öka utbytet av GUV:er bör man sträva efter en enhetlig lipidavsättning, vilket kan åstadkommas genom spinnbeläggning42 eller utnyttjande av kaffefläckseffekten41.

Ytterligare anmärkningar om protokollet:

Försiktighet bör iakttas så att flera membranproteiner (>10) rekonstitueras i genomsnitt per vesikel för att undvika stokastiska effekter. Undvik därför lipid-till-protein-förhållanden som är högre än 400:1 w/w. En slumpmässig orientering antas för de flesta proteiner.

Helst ska volymen av det totala antalet membranproteiner vara så liten som möjligt och ändå inte överstiga 10-20 % av liposomvolymen. Att lägga till större volymer kommer att introducera mer tvättmedel och majoriteten av förformade liposomer kan lysera, vilket kan ha en negativ effekt på rekonstitutionseffektiviteten.

Det är viktigt att extrudern är i jämvikt med lämplig lösning för att undvika utspädning av komponenterna under inkapslingen. Helst bör förjämviktslösningen också innehålla de lösliga enzymerna, men att inkludera enzymer kan vara för dyrt på grund av den relativt stora volym som behövs för extruderns förjämvikt. Därför utelämnar vi vanligtvis dessa komponenter och accepterar en utspädning på 5 % av enzymerna.

Jonoforer bör tillsättas till blandningar som innehåller proteoliposomer eftersom molekylerna är mycket hydrofoba och kan adsorbera till ytor om vesiklar inte är närvarande. Försiktighet bör iakttas så att volymen tillsatt vätska är låg (<1 % av den totala reaktionsvolymen). Kontroller görs för att verifiera att lösningsmedlen inte påverkar de metaboliska nätverken i vesiklarna. Jonoforkoncentrationer på cirka 1 μM är i allmänhet säkra för totala lipidkoncentrationer på ~3 mg/ml.

Försiktighet bör iakttas för att torka dropparna ordentligt. Om dropparna inte är tillräckligt torra är GUV-bildningen mindre effektiv eftersom lipider kommer att bilda lipidaggregat och MLV kan bildas när svälllösningen tillsätts.

Glukos används för att matcha osmolariteten hos det yttre till det inre mediet; den senare innehåller sackaros istället för glukos för att öka densiteten i vesiklarna och därmed underlätta sedimenteringen av GUV:erna. Dessutom förbättrar glukos i den yttre miljön faskontrasten, vilket gör vesikeln lättare synlig.

Stokastiska effekter är ett mycket mindre problem med GUVs; Men här kan förhållandet mellan yta och volym bli oacceptabelt lågt så att antalet membranproteiner (t.ex. transportörer) blir begränsande för det interna metaboliska nätverket. Metoden som beskrivs i detta protokoll tillåter inte exakt kontroll över storleken på proteoGUV:erna, men de flesta faller inom storleksintervallet 5-50 μm.

Sammanfattningsvis ger det arbete som presenteras här en omfattande översikt över rekonstitution av membranprotein och enzyminkapsling i lipidvesiklar av varierande storlek. Vi demonstrerar konstruktionen av funktionella vesiklar för syntes av ATP och byggstenar från enkla prekursorer som aminosyror och glycerol. Att rekonstituera membranproteiner i GUV:er är fortfarande utmanande, men de här presenterade protokollen banar väg för ytterligare utveckling inom syntetisk biologiforskning nedifrån och upp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna uppger att det inte finns några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna tackar Aditya Iyer för kloningen av pBAD-PercevalHR-genen och Gea Schuurman-Wolters för att ha hjälpt till med proteinproduktion och rening. Forskningen finansierades av NWO Gravitation-programmet "Building a Synthetic Cell" (BaSyC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Aldrich A9414-25g
Amicon cut-off filter Sigma Aldrich Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra 
BioBeads BioRad 152-3920
CHCl3 Macron Fine Chemicals MFCD00000826
D(+)-Glucose Formedium -
D(+)-Sucrose Formedium -
DDM Glycon D97002 -C
Diethyl Ether Biosolve 52805
DMSO Sigma-Aldrich 276855-100ml
DOPC Avanti 850375P-1g
DOPE Avanti 850725P-1g
DOPG Avanti 840475P-1g
DTT Formedium  DTT005
EtOH J.T.Baker Avantor MFCD00003568
Extruder Avestin Inc LF-1
Fluorimeter Jasco Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol BOOM 51171608
Gravity flow column Bio-Rad 732-1010
Hamilton syringe 100 µL Hamilton 7656-01
Hamilton syringe 1000 µL Hamilton 81320
Handheld LCP dispenser Art Robbins Instruments 620-411-00
Handheld Sonicator Hielscher Ultrasound Technology UP50H
HCl BOOM x76021889.1000
Imidazole Roth X998.4-250g
K2HPO4 Supelco 1.05099.1000
KCl BOOM 76028270.1
KH2PO4 Supelco 1.04873.1000
Kimwipe Kimtech Science 7552
Large Falcon tube centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006-100G
Light microscope Leica DM LS2
L-Ornithine Roth T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670-1KG
Microfluidic chip Homemade  PDMS based DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP Sigma-Aldrich A2754-1G
NaCl Supelco 1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer Isogen Life Science ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH Supelco 1.06498.1000
Needles for GUVs Henke-Ject 14-14575 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics Henke-Ject 14-15538 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose Cytiva 17526802
Nigericin Sigma-Aldrich N7143-5MG
Nutator VWR 83007-210
Osmolality meter Gonotec Salmenkipp Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner Plasma Etch PE-Avenger
Polycarbonate filter Cytiva Whatman Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 355647
Pyranine Acros Organics H1529-1G
Quartz cuvette (black) Hellma Analytics 108B-10-40
Sephadex G-75 resin  GE Healthcare 17-0050-01
Sonicator Sonics Sonics & Materials INC Sonics vibra cell
Syringe filter Sarstedt Filtropur S plus 0.2 0.2 µm
Syringe pump Harvard Apparatus A-42467
Tabletop centrifuge Eppendorf centrifuge 5418
Teflon spacer Homemade  Teflon based 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris PanReac AppliChem A1086.1000
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100 ml
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima Max-E
UV lamp Spectroline ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer Jasco V730 spectrophotometer
Valinomycin Sigma-Aldrich V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope Zeiss AxioObserver
β-Casein Sigma Aldrich C5890-500g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
  2. Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges. Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).
  3. Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. Industrial biomanufacturing: The future of chemical production. Science. 355 (6320), (2017).
  4. Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design. Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).
  5. Wang, A., et al. Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168 (2020).
  6. Kanter, G., et al. Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines. Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).
  7. Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).
  8. Jain, K. K. Synthetic biology and personalized medicine. Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).
  9. Schwille, P., Frohn, B. P. Hidden protein functions and what they may teach us. Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).
  10. Sachsenmeier, P. Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology. Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).
  11. Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).
  12. Godoy-Hernandez, A., et al. Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions. ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).
  13. Sikkema, H. R., et al. Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA. Sci Adv. 6 (47), 7697 (2020).
  14. Foucaud, C., Poolman, B. Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport. J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).
  15. Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization. Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).
  16. Simidjiev, I., et al. Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro. Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).
  17. Harris, N. J., Booth, P. J. Folding and stability of membrane transport proteins in vitro. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).
  18. Jackson, M. L., Litman, B. J. Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).
  19. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  20. Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).
  21. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).
  22. Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1 (2023).
  23. Lee, K. Y., et al. Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system. Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).
  24. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. Methods in Enzymology. , Elsevier. 161-176 (2009).
  25. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J. Vis. Exp. (95), e52281 (2015).
  26. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  27. Pols, T., et al. A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis. Nat Commun. 10 (1), 4239 (2019).
  28. Bailoni, E., Poolman, B. ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis. ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).
  29. Van Der Heide, T. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).
  30. Van'T Klooster, J. S., et al. Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).
  31. Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations. Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).
  32. Weiss, M., et al. Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics. Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).
  33. Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown. FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).
  34. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  35. Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459 (2019).
  36. Elias, M., et al. Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette. Micro Nano Eng. 8, 100064 (2020).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 044105 (2013).
  38. Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths. Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).
  39. Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4 (1), 2550 (2013).
  40. Setyawati, I., et al. In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters. eLife. 9, e64389 (2020).
  41. Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles. Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).
  42. Estes, D. J., Mayer, M. Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).

Tags

Metaboliska nätverk ur jämvikt rekonstitution av membranproteiner stora unilamellära vesiklar (LUV) gigantiska unilamellära vesiklar (GUV) bioreaktorer fluorescensbaserade sensorer enzyminkapsling metabolitinkapsling
Konstruktion av metaboliska nätverk ur jämvikt i nano- och mikrometerstora vesiklar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, … More

Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, B. Construction of Out-of-Equilibrium Metabolic Networks in Nano- and Micrometer-Sized Vesicles. J. Vis. Exp. (206), e66627, doi:10.3791/66627 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter