إعداد أنسجة المخ فأرة للالميكروسكوب Immunoelectron
Summary
وصفنا بروتوكول للنضح transcardiac إزالة والفئران وsectioning من الدماغ ، فضلا عن تلطيخ immunoperoxidase ، تضمين الراتنج ، وسامسونج sectioning من المقاطع الدماغ. عند الانتهاء من هذه الإجراءات ، والمواد immunostained مستعد للفحص المجهري مع انتقال الإلكترون.
Abstract
انتقال الإلكترون المجهر (تيم) مفيد للغاية لتصور دبقية صغيرة ، المقصورات oligodendrocytic التحت خلوية ، نجمي ، والعصبية (تغصن والعمود الفقري شجيري ، المحور ، محور عصبي عضال ، حوائط النواة) ، وكذلك على الخلايا والعضيات الهيكل الخلوي ، في الجهاز العصبي المركزي في ارتفاع القرار المكانية. جنبا إلى جنب مع تيم ، قبل تضمين كيمياء سيتولوجية مناعية يسمح للتمييز من العناصر الخلوية ذات خصائص متميزة قليلة ومعايير تحديد الهوية (على سبيل المثال ، دبقية perikarya والعمليات ، وعند استخدام الأجسام المضادة ضد علامة الخلايا الدبقية الصغيرة الخاصة Iba1 (الكالسيوم المتأينة الجزيء محول ملزمة 1 ؛ كما عرضت هنا)) ، وتحديد محتويات العصبي من العناصر الخلوية (مثل هرمون السيروتونين) ، وتوطين هذه التركيبية للبروتينات قابلة للذوبان أو الغشاء زمنيا (على سبيل المثال ، 5 ومستقبلات HT1A EphA4). هنا ، نحن تصف بروتوكول للنضح transcardiac من الفئران مع تثبيتي الأكرولين وإزالتها وsectioning من الدماغ ، فضلا عن immunoperoxidase – diaminobenzidine تلطيخ (DAB) ، التضمين الراتنج ، وسامسونج sectioning للأقسام الدماغ. عند الانتهاء من هذه الإجراءات ، والمواد immunostained مستعد لفحص مع تيم. عندما أجريت بدقة ، وهذا الأسلوب يوفر حلا وسطا بين الحفاظ ممتازة التركيبية الأمثل وكشف immunocytochemical.
Protocol
Discussion
هنا قد وصفنا على بروتوكول لإعداد الماوس لأنسجة المخ immunoelectron المجهري الذي يوفر حلا وسطا بين الحفاظ ممتازة التركيبية الأمثل وكشف immunocytochemical ، عندما يتم تنفيذها بدقة الإجراءات.
جنبا إلى جنب مع تيم ، وهذه الطريقة تمكن من التمييز بين ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر شاو مينغ وليو هاريس Gelbard ألف لاستخدام مضخة تمعجية وvibratome ، وكذلك كارين L. بنتلي وغايل شنايدر في مرفق مجهر إلكترون الأساسية للبحوث التابع لجامعة روتشستر المركز الطبي لتقديم المساعدة التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (EY019277) ، ومؤسسة وايتهول ، بوروز صندوق ويلكوم ، وألفريد سلون P. المؤسسة لبأنقرة. M.-È.T. وتمول من قبل دي فون LA RECHERCHE EN كيبيك سانتي (FRSQ) ما بعد الدكتوراه جائزة التدريب.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | Ovation Pharmaceuticals | |||
| Filter paper 315 24 cm | VWR | 28331-081 | ||
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 01680 | ||
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich (Aldrich) | 452173 | ||
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | ||
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | ||
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive | |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 82325 | ||
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher | 01-291-10 | ||
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher | NC9261784 | ||
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | ||
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | ||
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich (BioChemika) | 44581 | ||
| Gelatin subbed slides | VWR | 100241-864 | ||
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | ||
| Capsule mold | Electron microscopy Sciences | 70150 | ||
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | ||
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | ||
| Superfrost slides | Fisher | 22-178-277 | ||
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | |||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich (Sigma) | G7765 |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.
References
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
