Preparação do Tecido Cerebral de Rato imunomicroscopia
Summary
Nós descrevemos um protocolo para perfusão intracardíaca de ratos, remoção e corte do cérebro, bem como coloração por imunoperoxidase, a incorporação de resina, seccionamento e ultrafina das seções do cérebro. Após a conclusão desses procedimentos, o material imunocoradas está pronto para exame em microscopia eletrônica de transmissão.
Abstract
Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é extremamente útil para visualizar microglial, oligodendrocytic, astrocíticos e neuronal compartimentos subcelulares (dendrito, espinha dendrítica, axônio, axônio terminal, pericário), bem como suas organelas e do citoesqueleto intracelular no sistema nervoso central em alta resolução espacial. Combinado com o TEM, pré-incorporação imunocitoquímica permite a discriminação de elementos celulares com poucas características e critérios de identificação (por exemplo, microglial perikarya e processos, quando se utiliza um anticorpo contra o marcador microglia específicos Iba1 (cálcio ionizado molécula adaptador de ligação 1; como apresentado aqui)), identificando o conteúdo do neurotransmissor dos elementos celulares (por exemplo, serotoninérgicos) e sua localização ultra-estrutural de proteínas solúveis ou ligada à membrana (por exemplo, 5 HT1A e EphA4 receptores). Aqui, nós descrevemos um protocolo para perfusão intracardíaca de camundongos com acroleína fixador, remoção e corte do cérebro, bem como imunoperoxidase diaminobenzidina-coloração (DAB), a incorporação de resina, seccionamento e ultrafina das seções do cérebro. Após a conclusão desses procedimentos, o material imunocoradas está pronto para exame com TEM. Quando rigorosamente realizada, esta técnica fornece um excelente compromisso entre a preservação ultraestrutural e detecção imunocitoquímica ideal.
Protocol
Discussion
Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação do tecido cerebral do rato para imunomicroscopia que oferece um excelente compromisso entre a preservação ultraestrutural e detecção imunocitoquímica ideal, quando os procedimentos são rigorosamente executado.
Combinado com o TEM, este método permite distinguir elementos celulares com poucas características e critérios de identificação. Em particular, a coloração de imunoperoxidase DAB-de Iba1 permite identificar perikarya m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Shao-Ming Lu e Harris A. Gelbard para o uso de uma bomba peristáltica e vibratome, bem como Karen L. Bentley e Gayle Schneider no Electron Microscope Facility Núcleo de Pesquisa da Universidade de Rochester Medical Center para assistência técnica. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH (EY019277), Fundação Whitehall, Burroughs Wellcome Fund, e Alfred P. Sloan Foundation para AKM. M.-È.T. é financiado por um de Fonds la recherche en santé du Québec (FRSQ) prêmio de treinamento pós-doutorado.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | Ovation Pharmaceuticals | |||
| Filter paper 315 24 cm | VWR | 28331-081 | ||
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 01680 | ||
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich (Aldrich) | 452173 | ||
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | ||
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | ||
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive | |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 82325 | ||
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher | 01-291-10 | ||
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher | NC9261784 | ||
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | ||
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | ||
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich (BioChemika) | 44581 | ||
| Gelatin subbed slides | VWR | 100241-864 | ||
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | ||
| Capsule mold | Electron microscopy Sciences | 70150 | ||
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | ||
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | ||
| Superfrost slides | Fisher | 22-178-277 | ||
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | |||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich (Sigma) | G7765 |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.
References
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