Preparazione del tessuto cerebrale del mouse per la microscopia Immunoelectron
Summary
Abbiamo descritto un protocollo per la perfusione transcardiac di topi, rimozione e sezionamento del cervello, così come colorazione immunoperossidasi, incorporando resina, ultrasottili e sezionamento delle sezioni cervello. Al termine di queste procedure, il materiale immunostained è pronto per l'esame con microscopia elettronica a trasmissione.
Abstract
Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è estremamente utile per la visualizzazione della microglia, scomparti oligodendrocytic, astrociti, neuroni e subcellulare (dendrite, spine dendritiche, assone, assone terminale, pericarion), così come i loro organelli intracellulari e citoscheletro, nel sistema nervoso centrale a ad alta risoluzione spaziale. In combinazione con TEM, pre-embedding immunocitochimica consente la discriminazione di elementi cellulari con pochi tratti distintivi e dei criteri di identificazione (ad esempio microglia perikarya e processi, quando si utilizza un anticorpo contro la microglia specifico marcatore Iba1 (ionizzato molecola adattatrice calcio vincolante 1; presentato qui)), che indicano il contenuto neurotrasmettitore degli elementi cellulari (ad esempio, serotoninergici) e la loro localizzazione ultrastrutturale di proteine solubili o di membrana (ad esempio, 5 HT1A e EphA4 recettori). Qui, descriviamo un protocollo per la perfusione transcardiac di topi con acroleina fissativo, rimozione e sezionamento del cervello, così come immunoperossidasi-diaminobenzidina (DAB) colorazione, l'incorporamento resina, ultrasottili e sezionamento delle sezioni cervello. Al termine di queste procedure, il materiale immunostained è pronto per l'esame con TEM. Quando rigorosamente eseguito, questa tecnica offre un ottimo compromesso tra ottimale conservazione ultrastrutturali e rilevamento immunocitochimica.
Protocol
Discussion
Qui abbiamo descritto un protocollo per la preparazione del tessuto cerebrale di topo microscopia immunoelectron che offre un ottimo compromesso tra ottimale conservazione ultrastrutturali e rilevamento immunocitochimica, quando le procedure sono rigorosamente eseguiti.
In combinazione con TEM, questo metodo consente di distinguere elementi cellulari con pochi tratti distintivi e dei criteri di identificazione. In particolare, il immunoperossidasi-DAB colorazione dei Iba1 consente di identif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Shao-Ming Lu e Harris A. Gelbard per l'uso di una pompa peristaltica e vibratome, così come Karen L. Bentley e Gayle Schneider al Fondo Electron Microscope Nucleo di Ricerca dell'Università di Rochester Medical Center di assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato da finanziamenti del NIH (EY019277), Whitehall Fondazione, Burroughs Wellcome Fondo, e l'Alfred P. Sloan Foundation per AKM. M.-È.T. è finanziato da un Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) premio di formazione post-dottorato.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | Ovation Pharmaceuticals | |||
| Filter paper 315 24 cm | VWR | 28331-081 | ||
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 01680 | ||
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich (Aldrich) | 452173 | ||
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | ||
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | ||
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive | |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 82325 | ||
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher | 01-291-10 | ||
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher | NC9261784 | ||
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | ||
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | ||
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich (BioChemika) | 44581 | ||
| Gelatin subbed slides | VWR | 100241-864 | ||
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | ||
| Capsule mold | Electron microscopy Sciences | 70150 | ||
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | ||
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | ||
| Superfrost slides | Fisher | 22-178-277 | ||
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | |||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich (Sigma) | G7765 |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.
References
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