Vorbereitung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für transcardiac Perfusion von Mäusen, die Entfernung und Schnitte des Gehirns sowie Immunperoxidasefärbung, Harz eingebettet, und ultradünne Schnitte des Gehirns Abschnitten. Nach Abschluss dieser Verfahren ist die immungefärbt Material bereit zur Untersuchung mit der Transmissionselektronenmikroskopie.
Abstract
Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist äußerst nützlich für die Visualisierung von Mikrogliazellen, oligodendrocytic, Astrozyten und Neuronen subzellulären Kompartimenten (Dendriten, dendritischen Dorn, Axon, Axonterminal, Perikaryon), sowie deren intrazellulären Organellen und Zytoskelett, in das zentrale Nervensystem an hoher räumlicher Auflösung. Kombiniert mit TEM ermöglicht Pre-Embedding Immunzytochemie die Diskriminierung von zellulären Elemente mit wenigen Besonderheiten und Identifikation Kriterien (zB Mikroglia Perikarya und Prozesse, bei Verwendung eines Antikörpers gegen die Mikroglia-Marker Iba1 (ionisiertes Kalzium bindenden Adapter molecule 1; wie dargestellt hier)), die Identifizierung des Neurotransmitters Inhalte der zellulären Elemente (zB Serotonin) und deren ultrastrukturelle Lokalisierung von löslichen oder Membran-gebundenen Proteine (zB 5 HT1A und EphA4-Rezeptoren). Hier beschreiben wir ein Protokoll für transcardiac Perfusion von Mäusen mit Acrolein Fixativ, das Entfernen und Schneiden des Gehirns sowie Immunperoxidase-Diaminobenzidin (DAB)-Färbung, Harz eingebettet, und ultradünne Schnitte der Hirnschnitten. Nach Abschluss dieser Verfahren ist die immungefärbt Material bereit zur Untersuchung mit TEM. Wenn konsequent durchgeführt wird, bietet diese Technik einen hervorragenden Kompromiss zwischen optimaler ultrastrukturelle Konservierung und immunzytochemische Detektion.
Protocol
Discussion
Hier haben wir ein Protokoll für die Herstellung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie, dass er einen ausgezeichneten Kompromiss zwischen optimaler ultrastrukturelle Konservierung und immunzytochemische Nachweis, wenn die Verfahren konsequent durchgeführt liefert beschrieben.
Kombiniert mit TEM ermöglicht diese Methode, um zelluläre Elemente mit wenigen Besonderheiten und Identifikation Kriterien zu unterscheiden. Insbesondere ermöglicht die Immunperoxidase-DAB-Färb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Shao-Ming Lu und Harris A. Gelbard für den Einsatz einer Schlauchpumpe und Vibratom sowie Karen L. Bentley und Gayle Schneider am Elektronenmikroskop Forschung Core Facility der University of Rochester Medical Center für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH (EY019277), Whitehall-Stiftung, Burroughs Wellcome Fund und der Alfred P. Sloan Foundation, um AKM finanziert. M.-È.T. wird durch einen Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) Postdoc-Preis finanziert.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | Ovation Pharmaceuticals | |||
| Filter paper 315 24 cm | VWR | 28331-081 | ||
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 01680 | ||
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich (Aldrich) | 452173 | ||
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | ||
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | ||
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive | |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 82325 | ||
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher | 01-291-10 | ||
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher | NC9261784 | ||
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | ||
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | ||
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich (BioChemika) | 44581 | ||
| Gelatin subbed slides | VWR | 100241-864 | ||
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | ||
| Capsule mold | Electron microscopy Sciences | 70150 | ||
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | ||
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | ||
| Superfrost slides | Fisher | 22-178-277 | ||
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | |||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich (Sigma) | G7765 |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.
References
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