הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron
Summary
אנו מתארים פרוטוקול עבור זלוף transcardiac של הסרת, עכברים חתך של המוח, כמו גם מכתים אימונו, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של חלקים במוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.
Abstract
הילוכים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) הוא מאוד שימושי עבור חזותי microglial, תאים subcellular oligodendrocytic, astrocytic, ואת עצבי (דנדריט, עמוד השדרה דנדריטים, האקסון, האקסון לטרמינל, perikaryon), כמו גם אברונים תאיים שלהם cytoskeleton, במערכת העצבים המרכזית ברזולוציה מרחבית גבוהה. בשילוב עם TEM, טרום הטבעה immunocytochemistry מאפשר את האפליה של אלמנטים הסלולר עם מאפיינים בולטים כמה קריטריונים הזדהות (למשל, microglial perikarya ותהליכים, כאשר באמצעות נוגדן כנגד סמן microglia ספציפית Iba1 (סידן מיונן מחייב מתאם המולקולה 1, כפי שהוצגו כאן)), זיהוי תוכן הנוירוטרנסמיטר של אלמנטים הסלולרי (למשל, serotonergic) ולוקליזציה ultrastructural שלהם של חלבונים מסיסים או קרום הנכנס (למשל, 5 ו HT1A EphA4 קולטנים). כאן אנו מתארים פרוטוקול זלוף transcardiac של עכברים עם acrolein מקבע, הסרת חתך של המוח, כמו גם אימונו-diaminobenzidine (DAB) מכתים, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של בסעיפים המוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן לבדיקה עם TEM. כאשר מבוצע בקפידה, טכניקה זו מהווה פשרה מצוינת בין שימור ultrastructural אופטימלית זיהוי immunocytochemical.
Protocol
Discussion
כאן יש לנו תיאר פרוטוקול להכנת רקמת המוח העכבר עבור מיקרוסקופיה immunoelectron המספק פשרה מצוינת בין שימור ultrastructural אופטימלית זיהוי immunocytochemical, כאשר הנהלים מבוצעים בקפדנות.
בשילוב עם TEM, שיטה זו מאפשרת להבחין בין אלמנטים הסלולר עם מאפיי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים שאו-Ming Lu ו האריס א גלברד לשימוש משאבה vibratome peristaltic ו, כמו גם קארן ל בנטלי וגייל שניידר במתקן Core מיקרוסקופ אלקטרונים מחקר של אוניברסיטת רוצ'סטר המרכז הרפואי לקבלת סיוע טכני. עבודה זו מומנה על ידי מענקים מ-NIH (EY019277), וייטהול Foundation, קרן Wellcome בורוז, ואת פ אלפרד סלואן קרן אל AKM. M.-È.T. ממומנת על ידי דה Fonds en la משוכלל ונדיר סנטה קוויבק (FRSQ) בפרס אימון דוקטורט.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | Ovation Pharmaceuticals | |||
| Filter paper 315 24 cm | VWR | 28331-081 | ||
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 01680 | ||
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich (Aldrich) | 452173 | ||
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | ||
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | ||
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive | |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 82325 | ||
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher | 01-291-10 | ||
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher | NC9261784 | ||
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | ||
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | ||
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich (BioChemika) | 44581 | ||
| Gelatin subbed slides | VWR | 100241-864 | ||
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | ||
| Capsule mold | Electron microscopy Sciences | 70150 | ||
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | ||
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | ||
| Superfrost slides | Fisher | 22-178-277 | ||
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | |||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich (Sigma) | G7765 |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.
References
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
