Pulmonale epitheliale cellen kunnen worden geïsoleerd uit de luchtwegen van muizen en gekweekt bij de lucht-vloeistof interface als een model van gedifferentieerde respiratoire epitheel. Een protocol is beschreven voor het isoleren, kweken en het blootstellen van deze cellen om te mainstream sigarettenrook, om moleculaire reacties studie om deze milieu-toxine.
Pulmonale epitheliale cellen kunnen worden geïsoleerd uit de luchtwegen van muizen en gekweekt bij de lucht-vloeistof interface (ALI) als een model van gedifferentieerde respiratoire epitheel. Een protocol is beschreven voor het isoleren en het blootstellen van deze cellen naar mainstream sigarettenrook (CS), om epitheliale cel responsen studie naar CS blootstelling. Het protocol bestaat uit drie delen: de isolatie van epitheelcellen in de muis luchtpijp, het kweken van deze cellen in de lucht-vloeistof interface (ALI) als volledig gedifferentieerde epitheliale cellen, en de levering van geijkte mainstream CS om deze cellen in cultuur. Het ALI cultuur systeem maakt het mogelijk de cultuur van respiratoire epitheel onder omstandigheden die beter hun fysiologische omgeving dan de gewone vloeibare cultuur-systemen lijken. De studie van moleculaire en cellulaire reacties op long exposure CS is een cruciaal onderdeel van het begrijpen van de invloed van het milieu luchtvervuiling op de menselijke gezondheid. Onderzoeksresultaten op dit gebied kan uiteindelijk bijdragen aan inzicht in de etiologie van chronische obstructieve longziekte (COPD), en andere tabak gerelateerde ziekten, die grote mondiale gezondheidsproblemen vertegenwoordigen.
Het protocol beschrijft de isolatie van de muis tracheale epitheelcellen is een bewerking van de protocollen van U et al.., 1, en anderen 2-3 met wijzigingen. Zoals met elk protocol beschrijft cel isolatie, het meest kritische aspect is om besmetting van bacteriën of schimmels te vermijden door gebruik te maken strikte aseptische technieken. Een tweede kritische stap is om te voorkomen dat fibroblast verontreiniging van de culturen, die kan worden vermeden door zorgvuldige dissectie…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Emeka Ifedigbo voor technische bijstand en Dr Shivraj Tyagi voor waardevolle expertise. We danken ook de Harvard NeuroDiscovery Centrum voor hulp bij microscopie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een American Heart Association Predoctorale verlenen 09PRE2250120 aan Hilaire Lam, en het NIH subsidies, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, toegekend aan AMK Choi.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine | |
Pen/strep | Lonza | 17-602E | ||
Pronase | Roche | 10165921001 | Streptomyces griseus | |
Collagen I | BD biosciences | 354236 | From rat tail | |
Acetic Acid | Sigma | 338826-25 | ||
DNaseI | Sigma | DN25-100MG | From Bovine Pancreas | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V | |
Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | ||
Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175 | Without Ca++ or Mg++ | |
DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES | |
HEPES, 1M in H2O | Sigma | 83264-100ML | ||
L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | 200 mM | |
Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | ||
Insulin | Sigma | 16634-50MG | Bovine Pancreas | |
Apo-transferrin (human) | Sigma | T1147-100MG | ||
Cholera toxin | Sigma | C8052 | Vibrio Cholerae | |
Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse | |
Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | ||
NuSerum | BD Biosciences | 355100 | ||
Transwell | Corning Costar | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
|
Primaria 100 mm culture dish | Falcon | 353803 | ||
Pallflex membrane | Pall Life Sciences | EMFAB TX40H120-WW | ||
Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14″x14″x20″ Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2″ thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2″ size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2′ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector.
This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com).