エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離
Summary
肺上皮細胞は、マウスの気道から分離し、差別化された呼吸上皮のモデルとしての気液界面で培養することができます。プロトコルは、分離培養し、この環境毒素への分子応答を研究するために、たばこの主流煙にこれらの細胞を露出させるための記述されています。
Abstract
肺上皮細胞は、マウスの気道から分離し、差別化された呼吸上皮のモデルとしての気液界面（ALI）で培養することができます。プロトコルは、CSの曝露に上皮細胞の応答を研究するために、たばこの主流煙（CS）にこれらの細胞を分離し、公開するために記述されています。マウス気管、気液界面（ALI）として完全に分化した上皮細胞におけるこれらの細胞の培養、及び培養中のこれらの細胞に校正された主流CSの配信から気道上皮細胞の分離：プロトコルは、次の3つの部分から構成されています。 ALI培養系は、より密接に通常の液体培養系よりも生理の設定に似ている条件の下で呼吸上皮の文化を可能にします。 CSの暴露分子と肺細胞応答の研究は、人間の健康に対する環境大気汚染の影響を理解することの重要なコンポーネントです。この分野での研究成果は、最終的に慢性閉塞性肺疾患（COPD）、および世界の主要な健康上の問題を表す他のタバコ関連疾患の病因の理解に向けて貢献するかもしれない。
Protocol
Discussion
マウス気管上皮細胞の単離を記述するプロトコルは、1、。あなたらのプロトコルから適応、およびその他の変更で2-3。れるセルのアイソレーションを記述する任意のプロトコルと同様に、最も重要な側面は、厳格な無菌操作を用いて、細菌または真菌病原体からの汚染を避けるためです。 2番目に重要なステップは、ステップ1.19で説明されているように線維芽?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、貴重な専門知識のための技術支援と博士Shivraj TyagiためEmeka Ifedigboに感謝。我々はまた、顕微鏡の支援のためにハーバードのNeuroDiscoveryセンターに感謝します。この作品は、イレールラム、およびAMK崔に贈られるNIHの助成金、R01 – HL60234、R01 – HL55330、R01 – HL079904に許可を09PRE2250120博士号を取得する前のアメリカ心臓協会によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602E | ||
| Pronase | Roche | 10165921001 | Streptomyces griseus | |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | From rat tail | |
| Acetic Acid | Sigma | 338826-25 | ||
| DNaseI | Sigma | DN25-100MG | From Bovine Pancreas | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V | |
| Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175 | Without Ca++ or Mg++ | |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES | |
| HEPES, 1M in H2O | Sigma | 83264-100ML | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | 200 mM | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | ||
| Insulin | Sigma | 16634-50MG | Bovine Pancreas | |
| Apo-transferrin (human) | Sigma | T1147-100MG | ||
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Vibrio Cholerae | |
| Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse | |
| Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | ||
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | ||
| Transwell | Corning Costar | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
|
| Primaria 100 mm culture dish | Falcon | 353803 | ||
| Pallflex membrane | Pall Life Sciences | EMFAB TX40H120-WW | ||
| Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14″x14″x20″ Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2″ thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2″ size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2′ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector.
This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com).
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