에어 리퀴드 인터페이스에서 마우스 호흡기 상피 세포 및 실험 담배 연기에 노출의 분리
Summary
폐 상피 세포는 생쥐의 호흡기로부터 격리하고 차별 호흡기 상피의 모델로 공기 – 액체 인터페이스에서 교양 수 있습니다. 프로토콜이 환경 독소에 분자 반응을 연구하기 위해, culturing를 분리하고 주류 담배 연기 이러한 세포를 노출에 대해 설명합니다.
Abstract
폐 상피 세포는 호흡 생쥐의 넓이와 차별 호흡기 상피의 모델로 공기 – 액체 인터페이스 (ALI)에서 양식에서 격리 수 있습니다. 프로토콜은 CS에 노출되는 상피 세포의 반응을 연구하기 위해 주류 담배 연기 (CS) 이러한 세포를 분리하고 노출에 대해 설명합니다. 마우스 기관, 공기 – 액체 인터페이스 (ALI)로 완벽하게 차별화된 상피 세포에서 이러한 세포의 culturing, 문화에서 이러한 세포 보정 주류 CS의 배달에서기도 상피 세포의 분리 : 프로토콜은 세 부분으로 구성되어 있습니다. 알리 문화 시스템은보다 밀접하게 일반 액체 문화 시스템보다 생리 설정을 닮은 그 조건 하에서 호흡기 상피 조직의 문화 수 있습니다. CS 노출하는 분자 및 폐 세포 반응의 연구는 인간의 건강에 대한 환경 대기 오염의 영향을 이해의 중요한 구성 요소입니다. 이 분야에서 연구 결과는 궁극적으로 만성 폐쇄 폐 질환 (COPD), 주요 글로벌 건강 문제를 나타내는 다른 담배 관련 질병의 병인을 이해하는 방향으로 기여할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
마우스 tracheal 상피 세포의 격리를 나타내는 프로토콜 1. 당신이 외의 프로토콜에서 적응하고, 다른 수정 2-3. 것입니다 어떤 프로토콜 설명 셀 isolations와 마찬가지로 가장 중요한 부분은 엄격한 무균 기술을 사용하여 세균이나 곰팡이 병원균의 오염을 방지하는 것입니다. 두 번째 중요한 단계는 fibroblast의 tracheas주의 절개로 피할 수있는 문화의 오염, 그리고 1.19 단계?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 귀중한 전문 기술 지원 및 박사 Shivraj Tyagi에 대한 Emeka Ifedigbo 감사합니다. 우리는 또한 현미경 도움을위한 하버드 NeuroDiscovery 센터를 주셔서 감사합니다. 이 작품은 힐레어 램, 그리고 AMK 최에게 수여 NIH 보조금, R01 – HL60234, R01 – HL55330, R01 – HL079904에 부여 09PRE2250120 Predoctoral 미국 심장 협회가 일부 지원되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602E | ||
| Pronase | Roche | 10165921001 | Streptomyces griseus | |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | From rat tail | |
| Acetic Acid | Sigma | 338826-25 | ||
| DNaseI | Sigma | DN25-100MG | From Bovine Pancreas | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V | |
| Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175 | Without Ca++ or Mg++ | |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES | |
| HEPES, 1M in H2O | Sigma | 83264-100ML | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | 200 mM | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | ||
| Insulin | Sigma | 16634-50MG | Bovine Pancreas | |
| Apo-transferrin (human) | Sigma | T1147-100MG | ||
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Vibrio Cholerae | |
| Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse | |
| Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | ||
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | ||
| Transwell | Corning Costar | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
|
| Primaria 100 mm culture dish | Falcon | 353803 | ||
| Pallflex membrane | Pall Life Sciences | EMFAB TX40H120-WW | ||
| Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14″x14″x20″ Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2″ thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2″ size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2′ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector.
This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com).
References
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1320 (2002).
- Davidson, D. J. Murine epithelial cells: isolation and culture. J. Cyst. Fibros. 2, 59-62 (2004).
- Davidson, D. J., Kilanowski, F. M., Randell, S. H., Sheppard, D. N., Dorin, J. R. A primary culture model of differentiated murine tracheal epithelium. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279, L766-L778 (2000).
- Rabe, K. F. et al.; Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am. J Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
- Macnee, W. Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Clin. Chest Med. 28, 479-513 (2007).
- Tuder, R. M., Yoshida, T., Arap, W., Pasqualini, R., Petrache, I. State of the art. Cellular and molecular mechanisms of alveolar destruction in emphysema: an evolutionary perspective. Proc. Am. Thorac. Soc. 3, 503-510 (2006).
- Yao, H., Rahman, I. Current concepts on the role of inflammation in COPD and lung cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 375-383 (2009).
- van der Toorn, M. Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1156-L1162 (2007).
- Slebos, D. J. Mitochondrial localization and function of heme oxygenase-1 in cigarette smoke-induced cell death. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 36, 409-417 (2007).
- Kim, H. P. Autophagic proteins regulate cigarette smoke induced apoptosis: protective role of heme oxygenase-1. Autophagy. 4, 887-895 (2008).
- Chen, Z. H. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 3, e3316-e3316 (2008).
- Okuwa, K. In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system: A comparison of smoking regimens. Exp Toxicol Pathol. , (2009).
- St-Laurent, J., Proulx, L. I., Boulet, L. P., Bissonnette, E. Comparison of two in vitro models of cigarette smoke exposure. Inhal. Toxicol. 21, 1148-1153 (2009).
- Watson, A. M., Benton, A. S., Rose, M. C., Freishtat, R. J. Cigarette smoke alters tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 9 levels in the basolateral secretions of human asthmatic bronchial epithelium in vitro. J Investig. Med. 58, 725-729 (2010).
- Rennard, S. I. Cigarette smoke in research. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 479-480 (2004).
- Shapiro, S. D. Smoke gets in your cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 481-482 (2004).
