Hava Sıvı Arabirimi Fare Solunum Epitel Hücreleri ve Deneysel sigara dumanına maruz kalma izolasyonu
Summary
Pulmoner farelerin solunum yolu epitel hücreleri izole ve farklılaşmış bir solunum yolu epitel bir model olarak hava-sıvı arayüzü kültüre olabilir. Bu çevresel toksin moleküler yanıtların incelemek üzere bir protokol, tecrit, kültür ve bu hücreler ana sigara dumanına maruz için tarif edilir.
Abstract
Akciğer epitel hücreleri farelerin solunum yolu ve hava-sıvı arayüzü (ALI), farklılaşmış solunum yolu epitel bir model olarak kültüre izole edilebilir. CS maruz epitel hücre yanıtlarını araştırmak için bir protokol, ana sigara dumanı (CS) bu hücreler izole etmek ve sergilemek için tarif edilir. Fare trakea, hava-sıvı arayüzü (ALI) tam olarak farklılaşmış epitel hücreleri bu hücrelerin kültür ve kültür alanında bu hücrelerin kalibre ana CS teslim hava yolu epitel hücreleri izolasyonu: protokol üç bölümden oluşur. ALİ kültür sistemi, solunum yolu epitel kültürünü daha yakından sıradan sıvı kültür sistemleri daha fizyolojik ayar benzer koşullar altında izin verir. CS maruz kalma, moleküler ve akciğer hücresel yanıtları çalışmada, çevresel hava kirliliğinin insan sağlığı üzerindeki etkisini anlamak önemli bir bileşeni. Araştırma bulguları, bu alanda sonuçta kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) ve büyük küresel sağlık sorunları temsil eden diğer tütüne bağlı hastalıklar, etyolojisi anlamak yolunda katkıda bulunabilir.
Protocol
Discussion
Fare trakeal epitel hücreleri izole açıklayan protokol 1, Sen ve ark protokolleri adapte ve diğer modifikasyonlar ile 2-3. Hücre izolasyonların açıklayan herhangi bir protokol olduğu gibi, en kritik yönü, sıkı aseptik teknikler kullanılarak bakteriyel veya fungal patojenlerin bulaşmasını önlemek için. Ikinci bir kritik adım fibroblast tracheas dikkatli diseksiyon ile önlenebilir kültürlerin kirlenme, Adım 1.19 açıklandığı gibi negatif seçim önlemek için. Kü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz değerli uzmanlık için teknik yardım ve Dr. Shivraj Tyagi Emeka Ifedigbo teşekkür ederim. Ayrıca Harvard NeuroDiscovery Merkezi mikroskobu ile yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma, bir Amerikan Kalp Birliği tarafından hibe 09PRE2250120 Hilaire Lam ve AMK Choi verilen NIH hibe R01-HL60234 R01-HL55330 R01-HL079904 predoctoral kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602E | ||
| Pronase | Roche | 10165921001 | Streptomyces griseus | |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | From rat tail | |
| Acetic Acid | Sigma | 338826-25 | ||
| DNaseI | Sigma | DN25-100MG | From Bovine Pancreas | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V | |
| Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175 | Without Ca++ or Mg++ | |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES | |
| HEPES, 1M in H2O | Sigma | 83264-100ML | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | 200 mM | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | ||
| Insulin | Sigma | 16634-50MG | Bovine Pancreas | |
| Apo-transferrin (human) | Sigma | T1147-100MG | ||
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Vibrio Cholerae | |
| Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse | |
| Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | ||
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | ||
| Transwell | Corning Costar | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
|
| Primaria 100 mm culture dish | Falcon | 353803 | ||
| Pallflex membrane | Pall Life Sciences | EMFAB TX40H120-WW | ||
| Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14″x14″x20″ Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2″ thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2″ size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2′ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector.
This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com).
References
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1320 (2002).
- Davidson, D. J. Murine epithelial cells: isolation and culture. J. Cyst. Fibros. 2, 59-62 (2004).
- Davidson, D. J., Kilanowski, F. M., Randell, S. H., Sheppard, D. N., Dorin, J. R. A primary culture model of differentiated murine tracheal epithelium. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279, L766-L778 (2000).
- Rabe, K. F. et al.; Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am. J Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
- Macnee, W. Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Clin. Chest Med. 28, 479-513 (2007).
- Tuder, R. M., Yoshida, T., Arap, W., Pasqualini, R., Petrache, I. State of the art. Cellular and molecular mechanisms of alveolar destruction in emphysema: an evolutionary perspective. Proc. Am. Thorac. Soc. 3, 503-510 (2006).
- Yao, H., Rahman, I. Current concepts on the role of inflammation in COPD and lung cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 375-383 (2009).
- van der Toorn, M. Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1156-L1162 (2007).
- Slebos, D. J. Mitochondrial localization and function of heme oxygenase-1 in cigarette smoke-induced cell death. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 36, 409-417 (2007).
- Kim, H. P. Autophagic proteins regulate cigarette smoke induced apoptosis: protective role of heme oxygenase-1. Autophagy. 4, 887-895 (2008).
- Chen, Z. H. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 3, e3316-e3316 (2008).
- Okuwa, K. In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system: A comparison of smoking regimens. Exp Toxicol Pathol. , (2009).
- St-Laurent, J., Proulx, L. I., Boulet, L. P., Bissonnette, E. Comparison of two in vitro models of cigarette smoke exposure. Inhal. Toxicol. 21, 1148-1153 (2009).
- Watson, A. M., Benton, A. S., Rose, M. C., Freishtat, R. J. Cigarette smoke alters tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 9 levels in the basolateral secretions of human asthmatic bronchial epithelium in vitro. J Investig. Med. 58, 725-729 (2010).
- Rennard, S. I. Cigarette smoke in research. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 479-480 (2004).
- Shapiro, S. D. Smoke gets in your cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 481-482 (2004).
