זמן לשגות הדמיה של התרבות רקמת 3D מאפשר ללמוד התנהגות הנדידה של תאים בודדים שמקורם רוממות ganglionic בתגובה תמצית חלבון מופרדים מן קליפת המוח.
הגירה של תאים הוא תהליך משותף שמוביל לפיתוח ההבשלה של מערכת החולייתנים העצבים המרכזית (Hatten, 99). קליפת המוח מורכבת משני סוגי נוירונים בסיסיים: הגירוי ואת מעכבות. תאים אלה מתעוררות באזורים שונים ולנדוד לתוך קליפת בנתיבים שונים (פרלמן et al., 98). Interneurons מעכבות להעביר בעקיפין, ממקורות קורטיקליים, רובם מאזורים שונים של יואילו הוד מעלתם ganglionic (גלמן ואח', '09;. שו ואח', '04.). התנועה שלהם מחייב שליטה מדויקת spatiotemporal שהוטלו על ידי רמזים סביבתיים, כדי לאפשר הקמת cytoarchitecture קישוריות נאותה בקליפת המוח (Caviness & Rakic, 78; Hatten, 90; Rakic, 90). כדי לחקור את התנהגות הנדידה של תאים שנוצר באזורי שגשוג של יואילו הוד מעלתם ganglionic (GE) ב חמוסים היילוד במבחנה השתמשנו הסדר 3 התרבות ממדי Matrigel BD מטריקס. הגדרת התרבות מורכבת משני explants GE ו מקור חלבונים נבדק מופק בקליפת המוח ואת adsorbed על פלורסנט Retrobeads לטקס התשיעי ממוקם בין explants (Hasling ואח', '03;. Riddle et al, 97.). לאחר 2-3 ימים של תרבות, התאים מתחילים להופיע בקצה explant מראה נטייה לעזוב את רקמת בכיוון רדיאלי. הדמיה חיה מותר תצפית דפוסי הנדידה ללא צורך תיוג או סימון התאים. כאשר נחשף שברים של החלבון לחלץ המתקבל קליפת החמוס isochronic, התאים GE מוצג התנהגויות שונות כמו להישפט על ידי ניתוח כמותי הקינטית של תאים בודדים נעים.
כאן אנו מציגים מערכת פשוטה ללמוד ולנתח את התנהגות הנדידה של תאים עצביים בתגובה לאותות כימיים. ב מבחני חוץ גופית הגירה שימשו כדי לזהות מולקולות תאיים המשפיעים על תנועה של תאים. הפרדיגמה שלנו מבטיחה כי כל תא יחיד למד יש 3 מימדי (3D) בסביבה שבה לתקשר. זהו יתרון משמעותי על פני תרבויות שבה תאים נודדים מתוך explants נאלצים לנוע על המשטח השטוח של coverslip poly-D-ליזין מצופה, נטול ובכך של אינטראקציות עם תאי המטריצה (למשל הירשברג ואח' '10:. 8. Metin et al. '07). עם זאת ביחס בקנה מידה גדול יותר של תאים נודדים מעקב, הוא נשאר 2 מימדי, כמו תאים מוגבלים במאונך לשטח שבין coverslip הזכוכית בתחתית ואת המשטח העליון של Matrigel, שהוא דק יחסית חופש האופקי ההגירה. התקנה כזו מאפשרת ניתוח קל של התנועה, אשר נותר בעיקרו 2 מימדי. פרדיגמות 3D דומים המורכב explants GE או מחדש אגרגטים של תאים GE מוטבע קולגן או Matrigel, היו מועסקים בעבר באמצעות אגרגטים של תאים לבטא חלבון איתות מסוים כמקור לאותות כימיים (למשל Liodis ואח' '07;. מרטיני et .. א '09:. Nóbrega-Pereira et al '08, '03 Wichterle et al).. השיטה המוצגת כאן משתמשת במערכת שחרור איטי בצורה של חרוזים לטקס עם חלבונים דבק כדי לאפשר רמת מתמשכת בסביבה המקומית, שהוא גבוה יותר מאשר חלבונים הוסיף ישירות בינוני, מה שהופך את המערכת מתאימה במיוחד כאשר כמות זמין חלבון מוגבלת או כאשר תערובת מורכבת של חלבונים נבדק. הבחירה של חרוזים אינה מוגבלת לטקס מוצרים מבוססי, והוא כולל גם חומרים אחרים, למשל חרוזים agarose, כל אחד עם מאפיינים שונים. כדי להגביר עוד יותר את הצפיפות של assay, השתמשנו בשני explants apposed להפקיד החרוזים משני צדי המתרס. כדי להבטיח אזור מסוים המוצא, השתמשנו explants רוממות ganglionic כמקור של תאים. הערכנו הבדלים מנות המדיאלי ו לרוחב של מקורבו ganglionic, אבל לא רואה שום הבדלים. עלינו להדגיש כי מחקר זה משתמש חמוסים, במינים זה יואילו הוד מעלתם ganglionic המדיאלי ו לרוחב הפתיל מוקדם יותר מאשר אצל מכרסמים (Poluch ואח' '08.). באותו זמן התרבויות נוצרו (P0) יואילו הוד מעלתם ganglionic המדיאלי ו לרוחב היו התמזגו, למרות תאים רבים לאכלוס הניאוקורטקס עדיין נמצאים שנוצר נודדות. עם זאת, אם מקור אחיד של תאים באמת עדיף, השעיה תא יכול להיות מוכן מרקמת גזור מעורב ישירות עם Matrigel, או לחילופין הסתחרר למטה גלולה כתוצאה אגרוף לעשות "explants". השימוש לעיכול רקמת האנזימטית להכין את ההשעיה התא הוא מיואש, אפילו עקבות של פעילות שיורית proteolytic יכול לנזל Matrigel במהלך הניסוי. כמו כן, בדיקת נאותות צריך להיות מיושם על העיתוי של הגדרת התרבות. למרות Matrigel דורש תקופה של התחממות אל לפלמר, אפילו תקופה ממושכת מעט החשיפה של טיפות קטנות של Matrigel (משמש בפרוטוקול זה) לאוויר גורמת ייבוש תוצאות פגז כי הוא בלתי חדיר לתאי נודדות אשר לא ניתן למחוק על ידי כיסוי הבאים עם Matrigel טריים.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי DoD גרנט PT074620 (SLJ) ו-NIH גרנט R01NS245014 (SLJ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |