3D組織培養のタイムラプスイメージングは、大脳皮質から分画されたタンパク質抽出物に反応して、神経節隆起に由来する個々の細胞の遊走挙動を調べることができます。
細胞の遊走は、脊椎動物の中枢神経系の発達と成熟(ハッテン、'99)につながる一般的なプロセスです。興奮性と抑制:大脳皮質は、2つの基本的なニューロンタイプで構成されます。これらの細胞は、異なる領域で発生し、別の経路に沿って皮質(パールマンら 、'98)に移行する。抑制性介在は主に神経節隆起(。。Xu ら 、'04。ゲルマンら 、'09)のさまざまな地域から、接線方向に皮質下のソースからの移行。 (;ハッテン、'90、ラキッチ、'90キャヴィネス&ラキッチ、'78)彼らの運動は、大脳皮質における適切な細胞構築との接続の確立を可能にするために、環境手がかりによって課された精密時空間制御を必要とします。 in vitroにおける新生児フェレットの神経節隆起(GE)の増殖のゾーンで生成された細胞の遊走挙動を調べるために、我々は、BDマトリゲルマトリックスの3次元培養の配列を使用する。文化のセットアップは、2つのGEの外植片とテストされた蛋白質の源大脳皮質から抽出し、外植片(。。;リドルら 、'97 Hasling ら 、'03)との間に位置する蛍光ラテックスRetrobeads IXに吸着したから成っていた。文化の2〜3日後、細胞は半径方向に組織を残す傾向を示す片の端に現れ始めます。ライブイメージングは、細胞をラベルやマーキングの必要性なしに移住パターンの観察を可能にした。等時間隔的なフェレットの大脳皮質から得られた抽出タンパク質の分画にさらされた場合、GEの細胞は、個々の移動細胞の定量的動態解析によって判断すると異なる動作を表示します。
ここでは、化学物質の合図に応答する神経細胞の遊走挙動を研究し、分析するためにシンプルなシステムを提示する。vitroでの遊走アッセイでは細胞の運動に影響を及ぼす細胞外分子を識別するために使用されています。私たちのパラダイムは、検討した各々のセルが相互作用する3次元(3D)の環境を持つことが保証されます。 それは、細胞外マトリックス(例えばヒルシュら '10との相互作用のため、欠けている、ポリ- D -リジンコートしたカバースリップの平らな面に移動を余儀なくされている細胞は、外植片からの移行の文化上のかなりの利点である、8。メティンら '07)。細胞が縦方向に水平方向の自由と比較して下部のガラスのカバースリップと比較的薄いマトリゲル、の上面との間のスペースに制約されているとして、しかし追跡移行する細胞の大規模に関しては、それは、2次元のまま移行の。そのような設定はまだ本質的に2次元のままの動きを簡単に解析、することができます。 。マティーニら 、コラーゲンやマトリゲル中に埋め込 まれたGEの細胞のGEの外植片または再集計で構成される同様の3Dパラダイムは、以前に化学物質の手がかりのソース(例えばLiodis ら '07として特定のシグナル伝達タンパク質を発現する細胞の集合体を使用して、採用されたら'09、。。。ノブレガ-ペレイラら '08、Wichterle ら'03)。。タンパク質が時利用可能な量のシステムが特に適して、培地に直接添加よりも高い場合、ローカル環境の持続的なレベルを可能にするために付着したタンパク質を持つラテックスビーズの形で徐放システムを採用してここで紹介する方法、タンパク質は限られているかタンパク質の複雑な混合物がテストされている場合。ビーズの選択は、ラテックスベースの製品に限定し、また他の材料、例えば、アガロースビーズ、それぞれ異なる特性を持つが含まれていません。さらにアッセイの密度を高めるために、我々は反対側にビーズの堆積物に並列したtwo植片を使用。起源の特定の領域を確保するために、我々は細胞のソースとして神経節隆起の外植片を使用している。我々は、神経節隆起の内側と外側部分の違いを評価したが、違いを見ていない。我々は、本研究では、フェレットを使用していることを指摘しておきますが、この種では内側と外側神経節隆起は、げっ歯類(。Poluchら '08)よりも前のヒューズ。文化が作られた時間(P0)で内側と外側神経節隆起は新皮質の移入多くの細胞がまだ生成され、移行されているにもかかわらず、融合させた。細胞の真に均質なソースが好まれている場合は、、細胞懸濁液は、解剖組織から調製することができ、直接マトリゲルと混合、あるいはスピンダウンし、得られたペレットは、"植"を作るためにパンチ。タンパク質分解活性のさえ残存痕跡が実験の過程でマトリゲル液化できるため、細胞懸濁液を調製するための酵素組織消化の使用は、推奨されていません。また、デューデリジェンスは、文化のセットアップのタイミングに適用する必要があります。マトリゲルは、温暖化の期間は、乾燥空気の原因と遊走細胞を通さないで、消去することができるシェルの結果にマトリゲルの小滴の露出(としてこのプロトコルで使用されている)の少しでも長期間を重合するために必要ですが、新鮮なマトリゲルとその後の被覆による。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、DoDのグラントPT074620(シャングリラホテル)とNIHグラントR01NS245014(シャングリラホテル)によってサポートされていました。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |