وقت التصوير انقضاء زراعة الأنسجة 3D يسمح بدراسة سلوك الهجرة من الخلايا الفردية النابعة من سماحة العقدية كرد فعل لاستخراج البروتين مجزأة من القشرة الدماغية.
الهجرة من الخلايا هي عملية مشتركة تؤدي الى تطوير ونضوج النظام العصبي المركزي الفقاريات (Hatten ، '99). قشرة الدماغ تتكون من نوعين العصبية الأساسية : مثير والمثبطة. تنشأ هذه الخلايا في مناطق متميزة والهجرة الى القشرة على طول مسارات مختلفة (بيرلمان وآخرون ، '98). interneurons المثبطة تهاجر من مصادر هامشية تحت القشرية ، ومعظمهم من مناطق مختلفة من الفضيلة العقدية (غيلمان وآخرون ، '09؛ شو وآخرون ،'04). يتطلب مراقبة حركتهم spatiotemporal الدقيقة التي تفرضها منبهات البيئية ، للسماح لإنشاء التهندس الخلوي السليم والربط في القشرة الدماغية (Caviness وراكيتش ، '78؛ Hatten ،'90 ؛ راكيتش ، '90). لدراسة سلوك المهاجرة من الخلايا المتولدة في المناطق التكاثري للالبوارز العقدية (GE) في حديثي الولادة قوارض في المختبر استخدمنا 3 الترتيب الثقافة الأبعاد في مصفوفة Matrigel دينار بحريني. تألف الإعداد ثقافة explants GE اثنين ومصدرا للبروتينات اختبار المستخرج من قشرة الدماغ وكثف على الفلورسنت التاسع Retrobeads اللاتكس المتمركزة بين explants (Hasling آخرون ، '03؛ ريدل وآخرون ،'97). بعد 2-3 أيام من الثقافة ، وتبدأ الخلايا لتظهر على حافة يزدرع يظهر الميل إلى ترك الأنسجة في اتجاه شعاعي. التصوير مسموح يعيش رصد أنماط الهجرة من دون ضرورة لوضع العلامات أو الوسم الخلايا. عرض GE الخلايا عند تعرضها للكسور من البروتين الحصول عليها من استخراج القشرة isochronic النمس ، والسلوكيات المختلفة والحكم عليها من خلال التحليل الكمي لالحركية الفردية خلايا تتحرك.
هنا نقدم نظام بسيط لدراسة وتحليل السلوك المهاجرة من الخلايا العصبية في استجابة لاشارات كيميائية في المختبر فحوصات الهجرة استخدمت لتحديد الجزيئات التي تؤثر على تنقل خارج الخلية من الخلايا. لدينا نموذج يضمن أن كل خلية فردية درس لديه 3 الأبعاد (3D) مع البيئة التي تتفاعل. انها ميزة كبيرة على الثقافات حيث تهاجر خلايا من explants يضطر للتحرك على سطح مستو من بولي – D – يسين المغلفة ساترة ، وبالتالي يخلو من التفاعل مع المصفوفة خارج الخلية (على سبيل المثال هرشبيرغ آخرون '10؛ 8. ميتين وآخرون. '07). لكن فيما يتعلق على نطاق أوسع لتعقب الخلايا المهاجرة ، فإنه لا يزال 2 الأبعاد ، كما هي مقيدة رأسيا الخلايا إلى المسافة بين ساترة الزجاج على السطح السفلي والعلوي من Matrigel ، وهي رقيقة نسبيا بالمقارنة مع الحرية الأفقي للهجرة. مثل هذا الإعداد يسمح لتسهيل تحليل الحركة ، والذي لا يزال أساسا 2 الأبعاد. كانوا يعملون سابقا نماذج 3D مماثلة تتألف من explants GE – المجاميع أو إعادة الخلايا GE جزءا لا يتجزأ من الكولاجين أو Matrigel ، وذلك باستخدام خلايا من الركام تعبر عن بروتين معين يشير كمصدر للإشارات الكيميائية (مثل Liodis آخرون '07؛ مارتيني وآخرون . بن '09؛ نوبريجا ، وآخرون بيريرا'08 ؛ Wichterle آخرون '03). الطريقة المعروضة هنا يستخدم نظام الإفراج البطيء في شكل حبات اللثي مع بروتينات انضمت للسماح لمستوى مستدام في البيئة المحلية ، وهي نسبة أعلى من البروتينات وأضاف مباشرة إلى المتوسط ، مما يجعل نظام مناسب خصوصا عندما يتوفر مبلغ غير محدودة من البروتين ، أو عندما يتم اختبار خليط معقد من البروتينات. لا يقتصر اختيار حبات لمادة اللاتكس المنتجات القائمة ، ويشمل أيضا مواد أخرى ، على سبيل المثال agarose الخرز ، ولكل منها خصائص مختلفة. وذلك لزيادة كثافة مقايسة ، وتستخدم نحن اثنان explants apposed لإيداع الخرز على طرفي نقيض. لضمان وجود منطقة محددة من الأصل ، وقد استخدمنا explants البارزة العقدية كمصدر للخلايا. قمنا بتقييم الاختلافات في أجزاء الإنسي والجانبية للفضيلة العقدية ، ولكن لم ير أي خلافات. وينبغي أن نشير إلى أن هذه الدراسة يستخدم قوارض ، وفي هذه الأنواع البوارز الإنسي والجانبية العقدية الصمامات في وقت سابق من القوارض (Poluch آخرون '08). في الوقت الذي كان أدلى الثقافات (P0) كانت تنصهر في البوارز الإنسي والجانبية العقدية ، على الرغم من العديد من الخلايا لا تزال ملء المخية الحديثة التي يتم توليدها والمهاجرة. ومع ذلك ، إذا كان هو المفضل مصدر متجانسة حقا من الخلايا ، يمكن أن تكون على استعداد تعليق خلية من أنسجة تشريح والمختلط مباشرة مع Matrigel ، أو نسج أسفل بدلا من بيليه واللكم مما أدى إلى جعل 'explants. تم تخيف استخدام أنسجة الأنزيمية الهضم لإعداد التعليق الخلية ، بل بحثا عن آثار متبقية من نشاط بروتين يمكن تسييل Matrigel على مدار التجربة. أيضا ، وهو الحرص الواجب أن تطبق على توقيت الإعداد الثقافة. على الرغم من Matrigel يتطلب فترة من ارتفاع درجات الحرارة الى تتبلمر ، وحتى فترة ممتدة قليلا من التعرض لقطرات صغيرة من Matrigel (كما تستخدم في هذا البروتوكول) في الهواء يسبب التجفيف والنتائج في قذيفة التي لا يمكن اختراقها إلى الخلايا المهاجرة والتي لا يمكن محوها من من خلال تغطية لاحقة مع Matrigel الطازجة.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل وزارة الدفاع غرانت PT074620 (SLJ) وغرانت NIH R01NS245014 (SLJ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |