3D doku kültürü Zaman atlamalı görüntüleme, serebral korteks fraksiyone protein ayıklamak için tepki olarak ganglion eminens kaynaklanan bireysel hücrelerinin göç davranışı eğitim sağlar.
Hücre göçü, omurgalı ve merkezi sinir sisteminin gelişimi ve olgunlaşma (Hatten, '99) yol açar ortak bir süreç. Eksitatör ve inhibitör: Serebral korteks, iki temel nöronal türleri oluşur. Bu hücreler, farklı alanlarda ortaya çıkan ve farklı yollar boyunca (Pearlman ve ark. '98) Korteks göç . Inhibitör çoğunlukla ganglion eminences (. Xu ve ark, '04. Gelman ve ark, '09) farklı bölgelerinde, teğet subkortikal kaynaklardan göç. (Hatten, '90; Caviness & Rakic Rakic, '90, '78) Onların hareketi uygun serebral korteksteki hücre mimarisini ve bağlantı kurulması için izin vermek, çevresel ipuçları dayattığı hassas Spatiotemporal kontrolü gerektirir. Ganglion eminences (GE), in vitro yenidoğan ferrets proliferatif bölgelerde üretilen hücrelerin göç davranışlarını incelemek için bir BD Matrigel Matrix 3 boyutlu bir kültür düzenleme kullandı. Kültür kurulum iki GE eksplantlar ve serebral korteks çıkarılır ve eksplantlar (Riddle ve ark, '97 ve ark Hasling, '03) arasında konumlandırılmış floresan lateks Retrobeads IX adsorbe test proteinlerin kaynağıdır oluşuyordu. Kültür 2-3 gün sonra, hücreler, radyal yönde doku terk bir eğilim gösteren eksplant kenarında görünmeye başlar. Canlı görüntüleme, etiketleme veya işaretleme hücrelere gerek kalmadan göçmen desen gözlem izin verdi. Isochronic gelincik korteks elde ayıklamak protein fraksiyonları için maruz kaldığında, GE hücreleri nicel kinetik analiz bireysel hareket eden hücreler tarafından değerlendirilecek gibi farklı davranışlar sergilemiştir.
Burada kimyasal uyaranlara yanıt olarak sinir hücrelerinin göç davranışlarını incelemek ve analiz etmek için basit bir sistem sunuyoruz. In vitro göç deneyleri, hücre lokomosyon etkileyen ekstrasellüler molekülleri tanımlamak için kullanılır olmuştur . Paradigma, incelenen her bir hücre ile etkileşim kurmak için 3 boyutlu (3D) ortamında sahip olmasını sağlar. Ekstrasellüler matriks (örneğin Hirschberg ve ark '10 ile etkileşim dolayısıyla yoksun, poli-D-lizin kaplı lamel düz bir yüzey üzerinde hareket etmek zorunda hücreleri eksplant göçmen kültürleri üzerinde önemli bir avantaj; 8. Metin ve ark. '07). Ancak hücreleri dikey, yatay özgürlüğü göre, alt kısmında bulunan cam lamel ve nispeten ince Matrigel, üst yüzeyi arasındaki boşluk kısıtlı olarak izleme göç hücrelerinin büyük ölçekli saygı, 2-boyutlu kalır göç. Böyle bir kurulum hala esas olarak 2-boyutlu kalır, daha kolay hareket analizi sağlar. Martini ve ark; GE eksplantlar veya kollajen veya Matrigel gömülü GE hücrelerinin yeniden agrega oluşan Benzer 3D paradigmalar, daha önce, hücrelerin kimyasal ipuçları (örneğin Liodis ve ark '07 kaynağı olarak belirli bir sinyal protein ifade agrega kullanılarak istihdam edildi al '09. Nóbrega-Pereira ve arkadaşları '08; Wichterle ark '03). Burada sunulan yöntem, proteinleri orta doğrudan eklenen daha yüksek olan yerel çevre, sürdürülebilir bir düzeyde, izin sistemi, özellikle uygun hale yapıştırılır proteinleri ile lateks boncuk şeklinde yavaş salınımlı sistemi kullanır mevcut miktar protein proteinlerin karmaşık bir karışımı test zaman sınırlı veya. Boncuk seçim lateks bazlı ürünler sınırlıdır ve diğer malzemeler, örneğin agaroz boncuk, her biri farklı özelliklere sahip. Testinin yoğunluğu daha da artırmak için, biz iki zıt tarafta boncuk mevduat apposed eksplantlar kullandı. Kökenli belirli bir alan sağlamak için, biz, bir hücre kaynağı olarak ganglion eminens eksplantlar var. Biz ganglion eminens medial ve lateral kısımları farklılıklar değerlendirildi, ancak herhangi bir farklılık görmedim. Biz bu çalışmada ferrets kullandığı işaret etmelidir; bu türün medial ve lateral ganglion eminences (. Poluch ve ark '08) kemirgenlerde daha önce sigorta. Kültürleri yapıldığı zaman (P0), medial ve lateral ganglion eminences neokorteks doldurmamak birçok hücre, halen üretilen ve göç ediliyor olsa da, erimiş. Ancak gerçek anlamda homojen bir hücre kaynağı tercih edilir, bir hücre süspansiyonu disseke doku hazırlıklı olmak ve doğrudan Matrigel ile karışık, ya da alternatif olarak aşağı doğru bükülmüş ve çıkan pelet 'eksplantlar' yapmak için yumrukladı. Proteolitik aktivite bile kalan izleri deney boyunca Matrigel sıvılaştırılması için enzimatik doku sindirim hücre süspansiyonu hazırlamak için kullanımı önerilmez. Ayrıca, due diligence, kültür kurulum zamanlama uygulanacak. Matrigel ısınmanın bir dönemde, hatta biraz daha uzun süre kurutma hava nedenleri ve sonuçları göç hücreleri aşılmaz ve silinemez hangi bir kabuk Matrigel küçük damla maruz kalma (Bu protokolde kullanılan) polimerize gerektirmesine rağmen taze Matrigel sonraki kaplayarak.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, DoD Hibe PT074620 (SLJ) ve NIH Hibe R01NS245014 (SLJ) tarafından desteklenmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |