Imagem lapso de tempo de cultura de tecidos 3D permite estudar o comportamento migratório de células individuais provenientes de eminência ganglionar em reação ao extrato de proteínas fracionadas do córtex cerebral.
Migração de células é um processo comum que leva ao desenvolvimento e maturação do sistema nervoso central de vertebrados (Hatten, 99). O córtex cerebral é composto por dois tipos básicos de neurônios: excitatórios e inibitórios. Essas células surgem em áreas distintas e migrar para o córtex ao longo das rotas diferentes (Pearlman et al., 98). Interneurônios inibitórios migrar tangencialmente a partir de fontes subcortical, principalmente a partir de diferentes regiões do eminências ganglionares (Gelman et al, '09;. Xu et al, '04).. Seu movimento espaço-temporal requer um controle preciso impostas por estímulos ambientais, para permitir o estabelecimento de adequada citoarquitetura e conectividade no córtex cerebral (Caviness & Rakic, 78; Hatten, '90; Rakic, '90). Para estudar o comportamento migratório de células geradas em zonas proliferativa das eminências ganglionares (GE) em furões recém-nascido in vitro foi utilizado um arranjo de três dimensões em uma cultura Matrigel BD Matrix. A configuração de cultura consistiu em dois explantes GE e uma fonte de proteínas testadas extraído do córtex cerebral e adsorvido em fluorescentes Retrobeads latex IX posicionado entre os explantes (Hasling et al, '03;. Riddle et al, 97.). Depois de 2-3 dias de cultura, as células começam a aparecer na borda do explante mostrando uma propensão a deixar o tecido em uma direção radial. Imagens ao vivo permitiu a observação de padrões migratórios sem a necessidade de rotulagem ou marcação das células. Quando expostas a frações da proteína extrato obtido de córtex ferret isocrônico, as células GE apresentado comportamentos diferentes, a julgar pela análise cinética quantitativa de células individuais em movimento.
Aqui apresentamos um sistema simples para estudar e analisar o comportamento migratório de células neuronais em resposta a estímulos químicos. Em ensaios de migração in vitro têm sido usados para identificar as moléculas extracelulares que afetam a locomoção de células. Nosso paradigma garante que cada célula estudada tem um ambiente 3-dimensional (3D) com os quais interagem. É uma vantagem considerável sobre as culturas onde as células migram para fora de explantes são forçados a mover-se sobre a superfície plana de poli-D-lisina revestido lamela, portanto, desprovida de interações com a matriz extracelular (por exemplo, Hirschberg et al '10;. 8. Metin et al. '07). No entanto, com relação à maior escala de rastreamento de células migratórias, continua a ser de 2 dimensões, como as células são verticalmente restrito ao espaço entre as lamelas de vidro na parte inferior e a superfície superior do Matrigel, que é relativamente fina em comparação com a liberdade horizontal da migração. Tal configuração permite a fácil análise do movimento, que ainda permanece essencialmente 2-dimensional. Similar paradigmas 3D consistindo de explantes GE ou re-agregados de células GE embutidos em colágeno ou Matrigel, anteriormente empregado, utilizando agregados de células que expressam uma determinada proteína de sinalização como uma fonte de pistas químicas (por exemplo '07 Liodis et al;. Martini et .. al '09;. Nóbrega-Pereira et al 08; Wichterle et al '03).. O método aqui apresentado utiliza um sistema de liberação lenta na forma de esferas de látex com proteínas aderido para permitir um nível sustentado no ambiente local, que é maior do que proteínas adicionado diretamente ao meio, tornando o sistema particularmente adequado quando a quantidade de disponíveis proteína é limitado ou quando uma mistura complexa de proteínas é testada. A escolha de contas não se limita ao látex à base de produtos, e inclui também outros materiais, por exemplo, contas de agarose, cada um com características diferentes. Para aumentar ainda mais a densidade do ensaio, foram utilizados dois explantes apposed ao depósito contas em lados opostos. Para garantir uma área específica de origem, temos usado explantes eminência ganglionar como fonte de células. Foram avaliadas diferenças em porções medial e lateral da eminência ganglionar, mas não vejo qualquer diferença. Devemos salientar que este estudo utiliza furões; nesta espécie as eminências medial e lateral ganglionares fusível mais cedo do que em roedores (Poluch et al 08.). No momento em que as culturas foram feitas (P0) as eminências ganglionares medial e lateral foram fundidos, embora muitas células preencher o neocórtex ainda estão sendo gerados e migração. No entanto, se uma fonte verdadeiramente homogênea de células é preferível, uma suspensão de células pode ser preparado a partir do tecido dissecado e diretamente misturado com o Matrigel, ou, alternativamente, girou para baixo e uma pelota resultando perfurado para fazer "explantes". Uso de digestão enzimática do tecido para preparar a suspensão celular é desencorajado, pois mesmo resíduos de atividade proteolítica pode liquefazer Matrigel ao longo do experimento. Além disso, uma diligência tem de ser aplicado para o momento da instalação da cultura. Embora Matrigel requer um período de aquecimento para polimerizar, mesmo período um pouco prolongado de exposição de pequenas gotas de Matrigel (como utilizado neste protocolo) para o ar faz com que a secagem e resulta em um shell que é impenetrável para as células migram e que não podem ser apagados cobrindo posterior com Matrigel fresco.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo DoD Grant PT074620 (SLJ) e Grant NIH R01NS245014 (SLJ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |