Zeitraffer-Aufnahme von 3D-Gewebekultur ermöglicht das Studium Zugverhalten von einzelnen Zellen, die aus ganglionären Eminenz in Reaktion auf fraktionierte Proteinextrakt aus Großhirnrinde.
Migration von Zellen ist ein gemeinsamer Prozess, der zur Entwicklung und Reifung der Wirbeltiere des zentralen Nervensystems (Hatten, '99) führt. Die Hirnrinde besteht aus zwei grundlegenden neuronalen Typen: erregende und hemmende. Diese Zellen entstehen in unterschiedlichen Bereichen und wandern in die Rinde entlang verschiedener Routen (Pearlman et al., '98). Inhibitorischen Interneuronen tangential von subkortikalen Quellen migrieren, meist aus verschiedenen Regionen des Ganglion Eminenzen (Gelman et al, '09;. Xu et al, '04.). Ihre Bewegung erfordert eine genaue raumzeitliche Kontrolle durch Umweltreize verhängt, um den Aufbau einer ordnungsgemäßen Zytoarchitektur und Konnektivität in der Großhirnrinde zu ermöglichen (Caviness & Rakic, '78, Hatten, '90, Rakic, '90). Zur Untersuchung der Zugverhalten von Zellen in proliferativen Zonen des Ganglion Eminenzen (GE) bei neugeborenen Frettchen in vitro erzeugten verwendeten wir eine 3-dimensionale Kultur Anordnung in einer BD Matrigel Matrix. Die Kultur-Setup bestand aus zwei GE Explantate und eine Quelle der getesteten Proteine aus der Großhirnrinde extrahiert und adsorbiert an fluoreszierenden Latex Retrobeads IX zwischen den Explantaten (Hasling et al, '03.; Riddle et al, '97.) Positioniert. Nach 2-3 Tagen der Kultur, beginnen die Zellen am Rand der Explantation zeigt eine Neigung zu dem Gewebe in radialer Richtung zu verlassen scheinen. Live-Bildgebung erlaubt Beobachtung von wandernden Muster ohne die Notwendigkeit der Etikettierung oder Kennzeichnung der Zellen. Wenn auf Bruchteile des Proteins aus isochrone Frettchen Kortex erhaltene Extrakt ausgesetzt sind, zeigten die GE-Zellen unterschiedliche Verhaltensweisen als durch quantitative kinetische Analyse der einzelnen beweglichen Zellen beurteilt.
Hier präsentieren wir ein einfaches System zu studieren und zu analysieren Zugverhalten von neuronalen Zellen als Reaktion auf chemische Reize. In-vitro-Assays Migration wurden verwendet, um extrazelluläre Moleküle, die die Fortbewegung von Zellen zu identifizieren. Unser Paradigma ist sichergestellt, dass jede einzelne Zelle studiert eine 3-dimensionale (3D)-Umgebung, mit denen zu interagieren hat. Es ist ein erheblicher Vorteil gegenüber Kulturen, in denen Zellen wandern aus der Explantate sind gezwungen, auf der flachen Oberfläche der Poly-D-Lysin-beschichtete Deckglas zu bewegen und damit frei von Interaktionen mit der extrazellulären Matrix (zB Hirschberg et al '10;. 8. Metin et al. '07). Doch im Hinblick auf die größere Skala von Tracking wandernden Zellen, bleibt es 2-dimensional, da die Zellen vertikal in den Raum zwischen dem Deckglas auf dem Boden und der Oberseite des Matrigel, die relativ dünn ist im Vergleich zu den horizontalen Freiheit eingeschränkt der Migration. Eine solche Einrichtung ermöglicht eine einfachere Analyse der Bewegung, die immer noch im wesentlichen 2-dimensional. Ähnliche 3D Paradigmen, bestehend aus GE-Explantate oder re-Aggregate von GE-Zellen in Kollagen oder Matrigel eingebettet wurden bisher eingesetzt, wobei Aggregate von Zellen, die ein bestimmtes Signal-Protein als eine Quelle der chemische Reize (z. B. Liodis et al '07;. Martini et .. al '09;. Nóbrega-Pereira et al '08; Wichterle et al '03).. Die hier vorgestellte Methode verwendet eine langsame Freisetzung in Form von Latex-Beads mit eingehalten Proteine für eine nachhaltige Ebene im lokalen Umfeld, die höher sind als Proteine direkt hinzugefügt, um das Medium zu ermöglichen, wodurch das System besonders geeignet, wenn die Menge des verfügbaren Protein ist begrenzt, oder wenn eine komplexe Mischung von Proteinen getestet wird. Die Auswahl der Perlen ist nicht auf Latex-Basis Produkte beschränkt und schließt auch andere Materialien, zum Beispiel Agaroseperlen, die jeweils mit unterschiedlichen Merkmalen. Zur weiteren Erhöhung der Dichte des Tests verwendeten wir zwei Explantate apposed die Perlen Anzahlung auf gegenüberliegenden Seiten. Um sicherzustellen, einer bestimmten Gegend von Herkunft, haben wir ganglionären Eminenz Explantate als eine Quelle der Zellen verwendet. Wir untersuchten Unterschiede in medialen und lateralen Teile des Ganglion Eminenz, aber sehe keine Unterschiede. Wir weisen darauf hin, dass diese Studie Frettchen verwendet; bei dieser Art der medialen und lateralen Ganglion Eminenzen früheren Sicherung als bei Nagetieren (Poluch et al '08.). Zu der Zeit wurden die Kulturen gemacht (P0) den medialen und lateralen Ganglion Eminenzen verschmolzen wurden, obwohl viele Zellen Auffüllen der Neocortex noch erzeugt und Migration. Allerdings, wenn eine wirklich homogene Quelle von Zellen wird bevorzugt, kann eine Zellsuspension aus der sezierten Gewebe hergestellt werden und direkt mit dem Matrigel gemischt, oder alternativ abzentrifugiert und eine daraus resultierende Pellet gestanzt, um "Explantate" zu machen. Verwendung von enzymatischen Gewebe Verdauung zu der Zellsuspension vorbereitet wird abgeraten, denn selbst Restspuren von proteolytischer Aktivität kann verflüssigen sich im Laufe des Experiments Matrigel. Außerdem wurde eine Due Diligence auf den Zeitpunkt des Kultur-Setup verwendet werden. Obwohl Matrigel erfordert einen Zeitraum von Erwärmung zur Polymerisation, auch eine etwas längere Belichtung von kleinen Tropfen Matrigel (wie in diesem Protokoll), um die Luft verursacht Trocknung und resultiert in einer Schale, die undurchdringlich wandernden Zellen ist und kann nicht gelöscht werden durch nachträgliche Abdecken mit frischen Matrigel.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom DoD Stipendium PT074620 (SLJ) und NIH Grant R01NS245014 (SLJ) unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |