Time lapse avbildning av 3D vävnadsodling kan studera flyttande beteendet hos enskilda celler med ursprung från ganglieblockerande företräde som en reaktion på fraktionerade protein utdrag ur hjärnbarken.
Migration av celler är en vanlig process som leder till utveckling och mognad av ryggradsdjur centrala nervsystemet (Hatten, '99). Hjärnbarken består av två grundläggande neuronala typer: retande och hämmande. Dessa celler uppstår i olika områden och vandrar in i hjärnbarken längs olika vägar (Pearlman et al. '98). Hämmande interneuron migrera tangentiellt från subkortikala källor, främst från olika regioner i ganglieblockerande höjder (Gelman et al, '09;. Xu et al, '04.). Deras rörelse kräver en exakt Spatiotemporal kontroll som följer av miljö-signaler för att möjliggöra upprättandet av korrekta cytoarchitecture och anslutningsmöjligheter i hjärnbarken (Caviness & Rakic, '78, Hatten, '90, Rakic, '90). För att studera de flyttande beteende celler genereras i proliferativa områden i ganglieblockerande höjder (GE) hos nyfödda illrar in vitro använde vi en 3 dimensionell kultur arrangemang i en BD Matrigel Matrix. Kulturen inställning bestod av två GE explants och en källa till testade proteiner ur hjärnbarken och adsorberad till fluorescerande latex Retrobeads IX placerade mellan explants (Hasling et al, '03;. Riddle et al, 97.). Efter 2-3 dagar av kultur, cellerna börjar visas på kanten av Explantation visar en benägenhet att lämna vävnad i en radiell riktning. Bildproduktion tillåtet observation av vandringsmönster utan nödvändigheten av märkning av celler. När de utsätts för fraktioner av proteinet utvinns ur isochronic iller cortex, visas GE cellerna olika beteenden som bedöms av kvantitativ kinetisk analys av enskilda rörliga celler.
Här presenterar vi ett enkelt system för att studera och analysera vandrande beteende neurala celler som svar på kemiska signaler. In vitro migration-analyser har använts för att identifiera extracellulära molekyler som påverkar rörelseorganen av celler. Vår paradigmet säkerställer att varje enskild cell studerat har en 3-dimensionell (3D) miljö som man kan interagera. Det är en stor fördel över kulturer där celler migrerar ut ur explants tvingas flytta på den plana ytan av poly-D-lysin-belagda täckglas och därmed saknar interaktion med extracellulära matrix (t.ex. Hirschberg et al '10;. 8. Metin et al. '07). Men med avseende på större skala av spårning vandrande celler, är det fortfarande 2-dimensionella, eftersom cellerna är vertikalt begränsad till utrymmet mellan glaset täckglas på botten och ovansida Matrigel, som är relativt tunn jämfört med den horisontella frihet av migration. En sådan inställning gör det enklare analys av rörelse, som fortfarande är i huvudsak 2-dimensionella. Liknande 3D paradigm bestående av GE explants eller nytt aggregat av GE celler inbäddade i kollagen eller Matrigel, tidigare var anställd, med hjälp av aggregat av celler som uttrycker en viss signalering protein som en källa till kemiska signaler (t.ex. Liodis et al '07;. Martini et .. al '09;. Nobrega-Pereira et al '08; Wichterle et al '03).. Den metod som presenteras här används en slow release-system i form av latex pärlor med levt proteiner för att möjliggöra en bibehållen i den lokala miljön, vilket är högre än proteiner tillsättas direkt till mediet, vilket gör systemet särskilt lämplig när mängden tillgängligt protein är begränsad eller när en komplex blandning av proteiner testas. Valet av pärlor är inte begränsat till latex-baserade produkter, och omfattar även andra material, till exempel agaros pärlor, alla med olika egenskaper. För att ytterligare öka tätheten av analysen har vi använt två explants apposed till pärlorna insättning på motsatta sidor. För att säkerställa ett visst område i ursprung, har vi använt ganglieblockerande eminens explants som en källa av celler. Vi utvärderade skillnader i mediala och laterala delar av ganglieblockerande berömmelse, men såg inga skillnader. Vi bör påpeka att denna studie använder illrar, i denna art i mediala och laterala ganglieblockerande höjder säkringen tidigare än hos gnagare (Poluch et al '08.). Vid den tidpunkt då kulturerna gjordes (P0) den mediala och laterala ganglieblockerande höjder var smält, även om många celler befolka hjärnbarken fortfarande genereras och migrerar. Men om en verkligt homogen källa av celler är att föredra, kan en cellsuspension vara beredd från dissekeras vävnaden och direkt blandas med Matrigel, alternativt snurrade ner och en resulterande pellets stansade att göra "explants". Användning av enzymatisk vävnad matsmältningen att förbereda cellsuspension är avskräckt, för även rester av proteolytiska aktivitet kan smälta Matrigel under loppet av experimentet. Dessutom har en due diligence som skall tillämpas på tidpunkten för kulturen installationen. Även Matrigel kräver en period av uppvärmning till polymeriseras, till och med en något längre exponering av små droppar Matrigel (som används i detta protokoll) till luft uttorkar och resulterar i ett skal som är ogenomtränglig för vandrande celler och som inte kan raderas genom efterföljande täcker med färsk Matrigel.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av DoD Grant PT074620 (SLJ) och NIH Grant R01NS245014 (SLJ).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Neurobasal Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103-049 | |
N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
B-27 Supplement (50X) | Invitrogen | 0080085-SA | |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Biosciences | 354234 | |
Harris Uni-Core, 0.5mm size | Electron Microscopy Sciences | 69036-05 | Punch bore |
Green Retrobeads IX | Lumafluor, Inc. | Latex microspheres |