Nauwkeurige en eenvoudige meting van de pro-inflammatoire cytokine IL-1β met behulp van een volbloed stimulatie Assay
Summary
Beschrijven we een simpele immunoassay om de productie van pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-1 bèta productie, bij patiënten met autoinflammatory fenotypes te meten. Door het activeren van cellen in volbloed culturen met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen, in het bijzonder met lipopolysaccharide, kan cytokine secretie gemakkelijk worden geëvalueerd in volbloed supernatants.
Abstract
Inflammatoire processen als gevolg van de afscheiding van oplosbare mediatoren door immuuncellen, leiden tot verschillende manifestaties in de huid, gewrichten en andere weefsels, alsmede gewijzigde cytokine homeostase. Het aangeboren immuunsysteem speelt een cruciale rol in het herkennen van ziekteverwekkers en andere endogene gevaar stimuli. Een van de belangrijkste cytokines vrijgegeven door aangeboren immuuncellen is Interleukine (IL) -1. Daarom maken we gebruik van een volbloed stimulatie test om de secretie van inflammatoire cytokines te meten en in het bijzonder van de pro-inflammatoire cytokine IL-1β 1, 2, 3.
Patiënten met genetische disfuncties van het aangeboren immuunsysteem waardoor autoinflammatory syndromen vertonen een overdreven versie van volwassen IL-1β na stimulatie met LPS alleen. Met het oog op het aangeboren immuunsysteem component van de patiënten die zich presenteren met inflammatoire-geassocieerde aandoeningen te evalueren, gebruiken we een specifieke immunoassay om cellulaire immuunresponsen te detecteren pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), zoals de gram-negatieve bacteriële endotoxine, lipopolysaccharide (LPS ). Deze PAMPs worden herkend door pathogeen herkenning receptoren (PRRS), die worden gevonden op de cellen van het aangeboren immuunsysteem 4, 5, 6, 7. Een primaire signaal, LPS, in combinatie met een tweede signaal, ATP, noodzakelijk is voor de activering van de inflammasome, een multiprotein complex dat pro-IL-1β processen om haar rijpe, bioactieve vorm 4, 5, 6, 8, 9, 10.
De volbloed-test vereist slechts een minimale steekproef manipulatie tot cytokine productie te beoordelen in vergelijking met andere methoden die arbeidsintensieve isoleren en kweken van specifieke celpopulaties vereisen. Deze methode onderscheidt zich van andere volbloed stimulatie testen, maar eerder dan verdunnen monsters met een verhouding van RPMI media, voeren we een witte bloedcel direct tellen van verdund volbloed en daarom, het stimuleren van een bekend aantal witte bloedcellen in cultuur 2. De resultaten van deze bijzondere bloed-test aantonen dat er een nieuwe techniek bruikbaar in het ontrafelen van de patiënt cohorten die zich presenteren met autoinflammatory pathophysiologies.
Protocol
Discussion
De gehele beschreven bloed-test is een eenvoudige methode die beter nabootst fysiologische omstandigheden in vergelijking met andere technieken die celisolatie en uitgebreide steekproef verwerking en manipulatie zou vereisen. Deze methode maakt gebruik van de Cellometer Vision met AO te witte bloedcellen tellen in volbloed en daarom biedt een manier om nauwkeurig te standaardiseren op basis van samples cel aantallen.
Er dient te worden opgemerkt dat voor deze test, vol bloed moet worden getr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Research Program van het Nationaal Instituut van artritis en spier-en huidziekten van de National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD | 366480 | ||
| RPMI 1640 Media | GIBCO | 21870-100 | ||
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | ||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | ||
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | ||
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning Costar | 3524 | ||
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | InvivoGen | tlrl-eklps | ||
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | ||
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | ||
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
References
- Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).
- Thurm, C. W., Halsey, J. F. Measurement of cytokine production using whole blood. Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 .
- Mariathasan, S. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Gabay, C., Lamacchia, C., Palmer, G. IL-1 pathways in inflammation and human diseases. Nat Rev Rheumatol. 4, 232-241 (2010).
- Franchi, L., Elgenbrod, T., Muñoz-Planillo, R., Nuñez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat Immunol. 3, 241-247 (2009).
- Sims, J. E., Smith, D. E. The IL-1 family: regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 2, 89-102 (2010).
- Haug, R., Joø, G. B., Westvik, A. B., Kierulf, P. Chemokine production and pattern recognition receptor (PRR) expression in whole blood stimulated with pathogen-associated molecular patterns (PAMPs. Cytokine. 32, 304-315 (2005).
- Netea, M. G. Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1bin monocytes and macrophages. Blood. 113, 2324-2335 (2009).
- Latz, E. The inflammasomes: mechanisms of activation and function. Curr Opin Immnol. 22, 28-33 (2010).
- Masters, S. L., Simon, A., Aksentijevich, I., Kastner, D. L. Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammtory disease. Annu Rev Immunol. 27, 621-668 (2009).
