מדידה מדויקת ופשוטה 1β-IL Pro-ציטוקין דלקתי באמצעות גירוי Assay Whole Blood
Summary
אנו מתארים immunoassay פשוט למדוד את הייצור של ציטוקינים דלקתיים הפרו, כגון ייצור IL-1 בטא, בחולים עם הצגת פנוטיפים autoinflammatory. על ידי הפעלת התאים בתרביות דם שלם עם הפתוגן הקשורים דפוסי מולקולרית, במיוחד עם lipopolysaccharide, הפרשת ציטוקינים ניתן להעריך בנוחות supernatants הדם כולו.
Abstract
תהליכים דלקתיים הנובעים הפרשה של מתווכים מסיסים על ידי תאים חיסוניים, להוביל ביטוייה השונים בעור, במפרקים וברקמות אחרות, כמו גם הומאוסטזיס ציטוקינים משתנה. מערכת החיסון המולדת ממלא תפקיד מכריע בזיהוי פתוגנים אחרים גירויים סכנה אנדוגני. אחד הציטוקינים העיקריים שפורסמו על ידי תאים חיסוניים מולדים הוא אינטרלויקין (IL) -1. לכן, אנו מנצלים assay כל גירוי דם כדי למדוד את הפרשת ציטוקינים דלקתיים, ובמיוחד של הפרו דלקתי ציטוקינים IL-1β 1, 2, 3.
חולים עם תפקוד גנטיות של מערכת החיסון המולדת גרימת תסמונות autoinflammatory להראות שחרור מוגזם של בוגרת IL-1β על גירוי עם LPS לבד. כדי להעריך את מרכיב החיסון המולדת של חולים עם דלקת להציג הקשורים פתולוגיות, אנו משתמשים immunoassay ספציפיים כדי לזהות התגובה החיסונית התאית הפתוגן הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPs), כגון רעלן פנימי גרם שליליים של החיידק, lipopolysaccharide (LPS ). PAMPs אלה מוכרים על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן (PRRs), הנמצאים על תאים של מערכת החיסון המולדת 4, 5, 6, 7. האות הראשוני, LPS, בשיתוף עם האות המשני, ה-ATP, הוא הכרחי עבור הפעלת inflammasome, מורכבת multiprotein כי תהליכים תומכי IL-1β כדי ליצור בוגרת, ביו שלה 4, 5, 6, 8, 9, 10.
Assay דם שלם דורש מניפולציה מדגם מינימלי כדי להעריך ייצור ציטוקינים בהשוואה לשיטות אחרות הדורשות בידוד culturing עבודה אינטנסיבית של אוכלוסיות תאים ספציפיים. שיטה זו שונה מן האחרים מבחני גירוי כולו דם, ולא דילול דגימות עם יחס של RPMI התקשורת, אנו מבצעים תא דם לבן לספור ישירות מן הדם כולו מדולל ולכן, לעורר מספר ידוע של כדוריות הדם הלבנות בתרבות 2. תוצאות assay דם בפרט הזה להפגין טכניקה חדשנית שימושי הבהרת המחזורים המטופל עם הצגת pathophysiologies autoinflammatory.
Protocol
Discussion
Assay דם כל המתואר היא שיטה פשוטה יותר מקרוב מחקה מצבים פיזיולוגיים לעומת טכניקות אחרות, כי ידרוש בידוד תא ועיבוד מניפולציה מדגם נרחב. שיטה זו מנצלת את חזון Cellometer עם AO לספור בתאי הדם הלבנים בדם כולו, ולכן מספק דרך במדויק לתקנן דגימות מבוסס על מספרים סלולריים.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר עירונית של המכון הלאומי של דלקת מפרקים ומחלות עור השלד והשרירים וכן של המכון הלאומי לבריאות.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD | 366480 | ||
| RPMI 1640 Media | GIBCO | 21870-100 | ||
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | ||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | ||
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | ||
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning Costar | 3524 | ||
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | InvivoGen | tlrl-eklps | ||
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | ||
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | ||
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
References
- Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).
- Thurm, C. W., Halsey, J. F. Measurement of cytokine production using whole blood. Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 .
- Mariathasan, S. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Gabay, C., Lamacchia, C., Palmer, G. IL-1 pathways in inflammation and human diseases. Nat Rev Rheumatol. 4, 232-241 (2010).
- Franchi, L., Elgenbrod, T., Muñoz-Planillo, R., Nuñez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat Immunol. 3, 241-247 (2009).
- Sims, J. E., Smith, D. E. The IL-1 family: regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 2, 89-102 (2010).
- Haug, R., Joø, G. B., Westvik, A. B., Kierulf, P. Chemokine production and pattern recognition receptor (PRR) expression in whole blood stimulated with pathogen-associated molecular patterns (PAMPs. Cytokine. 32, 304-315 (2005).
- Netea, M. G. Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1bin monocytes and macrophages. Blood. 113, 2324-2335 (2009).
- Latz, E. The inflammasomes: mechanisms of activation and function. Curr Opin Immnol. 22, 28-33 (2010).
- Masters, S. L., Simon, A., Aksentijevich, I., Kastner, D. L. Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammtory disease. Annu Rev Immunol. 27, 621-668 (2009).
