La medición precisa y simple de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β mediante un análisis de sangre entera estimulación
Summary
Se describe un inmunoensayo simple para medir la producción de citoquinas pro-inflamatorias, como IL-1 beta, en pacientes con fenotipos autoinflamatoria. Mediante la activación de las células en cultivos de sangre total con el patógeno patrones moleculares asociados, específicamente con lipopolisacárido, la secreción de citoquinas puede ser convenientemente evaluada en los sobrenadantes de sangre total.
Abstract
Los procesos inflamatorios como resultado de la secreción de mediadores solubles de las células inmunes, conducen a diversas manifestaciones en la piel, articulaciones y otros tejidos, así como la homeostasis alterada de citoquinas. El sistema inmune innato desempeña un papel crucial en el reconocimiento de patógenos y otros estímulos endógenos peligro. Una de las principales citoquinas liberadas por células del sistema inmune innato es interleuquina (IL) -1. Por lo tanto, utilizamos un análisis de sangre toda la estimulación con el fin de medir la secreción de citoquinas inflamatorias y, específicamente, de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β 1, 2, 3.
Los pacientes con trastornos genéticos del sistema inmune innato que causan síndromes de autoinflamatoria muestran una versión exagerada de IL-1β madura a la estimulación con LPS solo. Con el fin de evaluar el componente inmune innato de los pacientes que presentan patologías inflamatorias asociadas, se utiliza un inmunoensayo específico para detectar la respuesta inmune celular a patógenos patrones moleculares asociados (PAMP), tales como las endotoxinas bacterianas gram-negativas, el lipopolisacárido (LPS ). Estos PAMPs son reconocidos por receptores de reconocimiento de patógenos (RRP), que se encuentran en las células del sistema inmune innato 4, 5, 6, 7. Una señal de primaria, LPS, junto con una señal secundaria, ATP, es necesaria para la activación de la inflamasoma, un complejo multiproteico que los procesos de pro-IL-1β a su forma madura, bioactivos 4, 5, 6, 8, 9, 10.
La prueba de sangre entera requiere una manipulación mínima de la muestra para evaluar la producción de citoquinas en comparación con otros métodos que requieren mucha mano de obra de aislamiento y cultivo de poblaciones celulares específicas. Este método se diferencia de otras pruebas de sangre entera estimulación, en lugar de diluir las muestras con una proporción de RPMI medios de comunicación, se realiza un recuento de glóbulos blancos directamente de la sangre entera diluida y, por tanto, estimular un número conocido de células blancas de la sangre en la cultura 2. Los resultados de este ensayo en sangre entera en particular demostrar una nueva técnica útil en el esclarecimiento de cohortes de pacientes que presentan fisiopatologías autoinflamatoria.
Protocol
Discussion
La prueba de sangre entera se describe un método simple que reproduce mejor las condiciones fisiológicas en comparación con otras técnicas que requieren aislamiento de células y procesamiento de muestras extensas y la manipulación. Este método utiliza la visión Cellometer con AO para contar los glóbulos blancos en la sangre y por lo tanto, proporciona una manera de estandarizar la precisión muestras basadas en el número de células.
Hay que tener en cuenta que para este ensayo, la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la piel de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD | 366480 | ||
| RPMI 1640 Media | GIBCO | 21870-100 | ||
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | ||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | ||
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | ||
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning Costar | 3524 | ||
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | InvivoGen | tlrl-eklps | ||
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | ||
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | ||
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
References
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