Genaue und einfache Messung der pro-inflammatorischen Zytokins IL-1β mit einem Vollblut Stimulation Assay
Summary
Wir beschreiben eine einfache Immunoassay auf die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL-1 beta Produktion, bei Patienten mit autoinflammatorisches Phänotypen zu messen. Durch Aktivierung von Zellen in Vollblut-Kulturen mit pathogen-associated molecular patterns, speziell mit Lipopolysaccharid kann Zytokinsekretion bequem in Vollblut Überstände ausgewertet werden.
Abstract
Entzündliche Prozesse, die sich aus der Sekretion von löslichen Mediatoren von Immunzellen, die verschiedenen Erscheinungsformen in der Haut, Gelenke und andere Gewebe sowie veränderte Zytokin-Homöostase führen. Das angeborene Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle bei der Anerkennung Krankheitserreger und andere endogene Gefahr Reize. Einer der wichtigsten Zytokine durch angeborene Immunsystem Zellen freigesetzt wird Interleukin (IL) -1. Daher verwenden wir eine Vollblut-Stimulation Assays, um die Sekretion von inflammatorischen Zytokinen zu messen und gezielt der pro-inflammatorischen Zytokine IL-1β 1, 2, 3.
Patienten mit genetischen Störungen des angeborenen Immunsystems verursacht autoinflammatorisches Syndrome zeigen eine übertriebene Version von reifen IL-1β nach Stimulation mit LPS allein. Um das angeborene Immunsystem Komponente der Patienten, die mit entzündlichen-assoziierten Erkrankungen derzeit zu bewerten, verwenden wir einen spezifischen Immunoassay für die zelluläre Immunantwort zu pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), wie die gram-negative bakterielle Endotoxine zu erkennen, Lipopolysaccharid (LPS ). Diese PAMPs werden durch Erreger recognition receptors (PRR), die auf die Zellen des angeborenen Immunsystems 4, 5, 6, 7 gefunden werden anerkannt. Eine primäre Signal, LPS, in Verbindung mit einem sekundären Signal, ATP, ist notwendig für die Aktivierung der Inflammasom, ein Multiproteinkomplex, dass Pro-IL-1β Prozesse ihrer reifen, bioaktive Form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
Die Vollblut-Assay erfordert nur minimale Probe Manipulation Zytokin-Produktion zu bewerten, wenn andere Methoden, die arbeitsintensive Isolierung und Kultivierung von spezifischen Zellpopulationen erfordern verglichen. Diese Methode unterscheidet sich von anderen Vollblut Stimulation Assays, sondern als Verdünnen von Proben mit einem Verhältnis von RPMI-Medium, führen wir eine weiße Blutzelle direkt count aus verdünntem Vollblut und damit zu stimulieren eine bekannte Anzahl von weißen Blutzellen in Kultur 2. Die Ergebnisse dieser besonderen Vollblut-Assay zeigen eine neuartige Technik nützlich bei der Aufklärung Patientengruppen präsentiert mit autoinflammatorisches Pathophysiologien.
Protocol
Discussion
Die Vollblut-Assay beschrieben ist eine einfache Methode, die genauer imitiert physiologischen Bedingungen zu anderen Techniken, die Zell-Isolierung und umfangreiche Stichprobe Bearbeitung und Manipulation erfordern würde verglichen. Diese Methode nutzt die Cellometer Vision mit AO zum weißen Blutkörperchen im Vollblut zu zählen und daher bietet die Möglichkeit, präzise Standardisierung Proben auf Zell-Zahlen.
Es ist zu beachten, dass für diesen Test, Vollblut in Heparin-Natrium-Röhr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Interne Research Program des National Institute of Arthritis and Bewegungsapparates und Hautkrankheiten der National Institutes of Health unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD | 366480 | ||
| RPMI 1640 Media | GIBCO | 21870-100 | ||
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | ||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | ||
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | ||
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning Costar | 3524 | ||
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | InvivoGen | tlrl-eklps | ||
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | ||
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | ||
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
References
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